200 孙月娥,夏文水,陈 洁*(江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡214122)
摘 要:在叔丁醇中以二十二碳六烯酸(DHA)乙酯和海藻糖为原料,通过固定化脂肪酶催化合成DHA海藻糖酯,并对其分离纯化方法进行研究。确定DHA海藻糖酯的薄层层析(TLC)条件:展开剂为乙酸乙酯/甲醇/水(815/1/015,v/v/v),碘蒸气显色10min;硅胶柱层析条件:正己烷/异丙醇/甲醇(5/4/1和4/4/2,v/v/v)梯度洗脱,流速113mL/min,1管/7min收集洗出液;用半制备高效液相色谱(HPLC)进一步纯化单酯收集液,经分析型HPLC检测纯度后用核磁共振(NMR)方法进行结构鉴定,确定为DHA藻糖单酯。关键词:二十二碳六烯酸(DHA),海藻糖酯,固定化脂肪酶,纯化,核磁共振(NMR)
Separation,purificationandidentificationofdocosahexaenoyltrehalose
SUNYue-e,XIAWen-shu,iCHENJie*(StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China)Abstrac:tDocosahexaenoyltrehalose(DHA)wassynthesizedfromdocosahexaenoicacidethylesterandtrehaloseintert-butanolusingmimobilizedlipaseasbiocatalyst1Thepurificationandanalysismethodswereinvestigated1Themobilephaseforthethinlayerchromatography(TLC)wasethylacetate/methanol/water(815/1/015,v/v/v)andiodinewasusedfordevelopment1Thesilicagelcolumnchromatographyconditionswereasfollows:gradientmobilephasesofhexane-isopropanol-methanol5B4B1(v/v/v)and4B4B2(v/v/v)wereusedinturn1Theflowratewas113mL/minandtheeluentof1tube/7minwascollected1Theeluentofmono-docosahexaenoyltrehalosewaspurifiedwithsemi-preparativehighperformanceliquidchromatographyHPLCfurtherandthenwasidentifiedbynuclearmagneticresonance(NMR)1Keywords:docosahexaenoicacid(DHA);docosahexaenoyltrehalose;mimobilizedlipase;purification;NMR中图分类号:TS20112+3 文献标识码:A 文章编号:1002-0306(2010)03-0200-04
收稿日期:2009-05-05 *通讯联系人作者简介:孙月娥(1973-),女,博士研究生,研究方向:食品脂质氧化。基金项目:国家自然科学基金课题(20401007)以及江苏省创新人才基金课题(BK2006503)支持。
非水相酶法催化酯交换反应是一个崭新的研究领域,与传统的化学合成法相比,酶催化合成具有反应条件温和、选择性高、副产物少等优点。大量研究证实,DHA为人体必需的多不饱和脂肪酸,具有抑制血小板凝聚、抗血栓、防治心脑血管疾病[1]、降低冠心病患者心肌梗塞死亡率[2]、促进智力发育等功能[3],此外,还具有抗肿瘤作用[4-5]。海藻糖是天然双糖中较稳定的二糖,无还原性,在食品中加热不发生美拉德反应。海藻糖作为一种天然二糖,它不仅具有其它低聚糖的特性,而且还具有独特的生物活性)))对生物体和生物分子具有独特的非特异性保护作用[6]。研究表明,许多生物在胁迫环境(如饥饿、高温、冷冻、干燥、高渗、辐射、有毒物质等)下表现出的抗逆耐受力与体内的海藻糖含量有直接的关系[7-8]。因此,通过酯交换反应把海藻糖和DHA结合成酯能同时发挥两种活性成分的生物学功能。本文主要研究了非水相脂肪酶催化合成DHA海藻糖酯的分离纯化方法和鉴定方法,即通过薄层层析、硅胶柱层析和半制备反相HPLC分离纯化目标产物,采用液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用系统(LC-ESI-MS)及核磁共振技术对DHA海藻糖单酯进行鉴定。1 材料与方法111 材料与设备硅胶(200~300目)、硅胶板(G254) 青岛海洋化工;甲醇(色谱纯) 江苏汉邦科技有限公司;海藻糖(食品级) 日本林原公司;DHA乙酯(含量>75%) 无锡市迅达海洋生物制品厂赠送;4!分子筛、叔丁醇及其它有机溶剂 分析纯,中国医药集团上海试剂有限公司;固定化脂肪酶Novozym435 诺201
维信公司。Waters高效液相色谱-质谱联用仪、Waters半制备型高效液相色谱仪 美国Waters公司;LC20A分析型高效液相色谱仪 日本岛津公司;Seastar旋转蒸发器 无锡星海王生化设备有限公司;水浴恒温振荡器 上海精宏实验设备有限公司;BRUKER500MHz核磁共振仪 德国Bruker公司。112 实验方法11211 非水相酶法合成DHA海藻糖酯 在250mL圆底烧瓶(包裹锡箔纸)中分别加入150mL预脱水的叔丁醇、115g海藻糖、4124gDHA乙酯、115g固定化脂肪酶Novozym435,充氮保护,在50e恒温水浴振荡器(150r/min)中避光反应50h。11212 液质联用分析(HPLC-MS)1121211 色谱条件 色谱柱,YMC-PackODS-A,416mm@250mm,5Lm;流动相A,超纯水(013%甲酸);流动相B,甲醇;流动相C,正己烷;梯度洗脱程序:0~15min,A20%~0%,B80%~100%;15~30min,B90%~100%,C0%~10%。流速,1mL/min;检测波长,205nm;柱温,30e;进样量10LL。1121212 质谱条件(MS) WatersPlatformZMD4000,电喷雾离子化源,正离子模式ES+:毛细管电压4120kV,锥孔电压36V,离子源温度100e,脱溶剂气温度250e,质量范围(m/z)200~1400,光电倍增器电压650V,Analyser真空度216e-5mBar,气体流速413L/h。负离子模式ES-:毛细管电压4123kV,锥孔电压36V,离子源温度100e,脱溶剂气温度250e,质量范围(m/z)200~1400,光电倍增器电压650V,Analyser真空度216e-5mBar,气体流速413L/h。11213 硅胶柱层析分离纯化 将反应液过滤,除去固定化脂肪酶,减压浓缩,浓缩液上硅胶层析柱(硅胶200~300目,30mm@400mm),流动相为正己烷/异丙醇/甲醇=5/4/1、4/4/2(v/v/v)梯度洗脱,流速为113mL/min,按1管/7min分段收集洗出液,同时进行TLC检验。将斑点相同者用分析型HPLC进一步检测,合并杂质较少的收集管中的流出物,将其进行减压浓缩后,用半制备液相色谱进一步分离纯化。11214 薄层色谱(TLC)分析 将经过硅胶柱层析收集的粗分离液在硅胶薄层板上点样,展开剂为乙酸乙酯/甲醇/水(815/1/015,v/v/v),展开10min,碘蒸气显色。11215 半制备液相色谱纯化 色谱条件:SunfireC18
色谱柱(150mm@19mmi1d1,10Lm),流动相甲醇B水
(v/v)=85B15,流速810mL/min,检测波长205nm,进样量500LL,柱温30e。11216 分析型HPLC分析 岛津LC-20A分析型HPLC色谱条件:SunfireC18反相色谱柱(150mm@416mmi1d1,5Lm),流动相为甲醇B水(v/v)=85B15,二极管阵列检测器(PDA),流速110mL/min,上样量10LL,检测波长205nm,柱温30e。11217 DHA海藻糖单酯结构鉴定 核磁共振(NMR):样品溶解于氘代甲醇中,用BRUKER500MHz核磁共振仪测定产物的13CNMR图谱。
2 结果与分析211 DHA海藻糖酯的合成与HPLC-MS分析DHA乙酯与海藻糖进行酯交换反应的过程见图1,由于海藻糖是分子结构对称的二糖,6-和6c-位置的羟基较活跃,因此,有可能在6-OH和6c-OH上进行酯交换反应,生成相应的DHA海藻糖的单酯和二酯。
图1 DHA海藻糖酯的合成路线实验中得到的合成反应液经过滤、梯度洗脱和在线柱后质谱鉴定,结果如图2和图3所示。图2显示,合成反应液经过液相色谱仪后出现较多的峰,但是经在线质谱检测,发现只是在保留时间为8127min和17154min的组分为可能的目标产物。
图2 DHA海藻糖酯反应液的色谱分离图
图3 DHA海藻糖酯的ESI-MS离子流谱电喷雾电离是通过常压电离源,使待分析样品的分子质子化而生成单电荷离子[9-11]。图3(a)为保留时间8127min的组分的MS图谱,DHA海藻糖单酯的相对分子质量为652135,ES-图谱上出现的m/z值为65117的峰,是[M1-H]的质谱信号。其它m/z值为69718、32713、130413的峰分别为[M1+HCOO-]、[C22H31O2]-(DHA酸根)、[2M1-1]的质谱信号;而ES+图谱上出现的m/z值为67517、69118、132812的峰分别为[M1+Na]、[M1+K]、[2M1+Na]的质谱信号,因此证明了DHA海藻糖单酯的存在。图3(b)为