1080809095 应用微生物学进展 徐燕 恶臭假单胞菌的应用研究简介 徐燕 （上海交通大学国家教育部微生物代谢重点实验室） _____________________________________________________________________ 摘要：本文通过查阅相关文献，简要介绍了假单胞菌的微生物学特性。主要对恶臭假单胞菌在生物降解修复环境污染，原酶液发酵生产活性物质，抗菌制剂在生物农药领域应用研究三方面做了主要介绍，并就其的生物安全性进行了综述。 关键词：恶臭假单胞菌；生物降解；抗菌制剂

一、恶臭假单胞菌微生物学性质 1.拉丁学名：Pseudomonas putida 2.形态：革兰氏阴性菌，需氧，直或微弯的杆菌，不产芽孢，以单极毛或1～2根极生鞭毛运动，氧化酶阳性，接触酶阳性，不能在酸性条件下生长。（图1）

3.培养条件：25℃ 需氧培养 蛋白胨培养基：蛋白胨10 g NaCl 5 g 琼脂20 g 水1 L pH 7.2 4.菌种保藏：保藏于-70℃，40％的甘油管中 5.用途：

（1）用于生物降解环境污染物苯酚等； （2）某些菌种产生的次级代谢物可用作植物抗生物质； （3）其为PGPR（植物生长促生菌）类环境友好菌，可定殖在植物根部，促进植物生长。

二、恶臭假单胞菌的应用

1．恶臭假单胞菌DLL2E4对苯酚的降解 对硝基苯酚( PNP)是重要的环境污染物,南京农大沈文静等研究者已经从不同环境样品中分离出大量的能够降解PNP的微生物[ 1 ] 。已有研究表明,微生物好氧降解PNP的

途径主要有2条: (1)对苯二酚(HQ)途径。PNP在单加氧酶作用下,直接脱去硝基,随后生成HQ, HQ在对苯二酚1, 2 -双加氧酶作用下打开苯环。该途径常见于革兰阴性细菌中。(2)偏三苯酚途径。PNP在相应酶的作用下,

图1 恶臭假单胞菌电镜观察

- 1 - 1080809095 应用微生物学进展 徐燕 依次生成4-硝基儿茶酚和偏三苯酚,最后在偏三苯酚1, 2 -双加氧酶作用下打开苯环。该途径常见于革兰阳性细菌中[ 2 - 4 ] 。

恶臭假单胞菌( Pseudomonas putida) DLL2E4是一株降解PNP性能优良的革兰阴性菌,在以PNP为唯一碳源的液体基础盐培养基中,能够在9h内完全降解0.8mmol PNP[ 5 ] 。早期的研究表明,DLL2E4降解PNP

是通过对苯二酚途径进行的[ 6 ] 。但邓海华[ 7 ]利用已报道的偏三苯酚1, 2 -双加氧酶基因序列,设计保守引物成功地从DLL2E4中扩增得到偏三苯酚1, 2 -双加氧酶基因( pnpC)

的保守序列,表明DLL2E4中存在复杂的PNP代谢途径。 基因敲除是研究基因功能的有力工具。南京农大生命学院环境微生物工程重点实验室通过同源重组成功地敲除了DLL2E4中的pnpC基因,比较了原始菌株和敲除菌株对

PNP的不同降解特性,初步研究了恶臭假单胞菌DLL2E4中偏三苯酚1, 2 -双加氧酶( PnpC)在PNP代谢中的作用。 由于代谢的多样性,微生物在降解PNP时,不仅仅局限于革兰阴性细菌的对苯二酚途径和革兰阳性细菌的偏三苯酚2种途径。ROLDAN等[8]报道了在光合细菌荚膜红细菌

(Rhodobacter capsulatus)中存在一条新的

PNP代谢途径。该途径在苯环开环之前并未脱硝基,而是PNP在依赖于NADH的单加氧酶作用下生成4-硝基儿茶酚,然后直接邻位开环生成4 - 硝基酮己二酸,再脱硝基进入相应循环。 根据该试验的结果, 以及先前的试验,沈文静等人推测DLL2E4中存在一条与革兰阴性细菌中常见的对苯二酚途径不同的PNP 代谢途径。具体过程如下: PNP在单加氧酶的作用下生成对苯二酚,对苯二酚在羟化酶的作用下生成偏三苯酚,偏三苯酚在偏三苯酚1, 2 -双加氧酶( PnpC)作用下开环,进入相应循环, 这个推测还需要具体的试验结果加以验证。通过对恶臭假单胞菌模式菌株KT2440基因组全序列的分析,发现KT2440具有2个不同的邻苯二酚1, 2 -双加氧酶[9] 。其他假单胞菌属菌株基因组中也发现了邻苯二酚1, 2 -双加氧酶。分析PNP和邻苯二酚诱导的DLL2ΔpnpC、DLL2E4粗酶液对邻苯二酚的活性发现,在DLL2ΔpnpC降解PNP过程中,存在另一个与开环相关的双加氧酶, 替代了PnpC的功能。但PNP诱导DLL2ΔpnpC产生的替代PnpC功能的双加氧酶与邻苯二酚诱导DLL2ΔpnpC产生的降解邻苯二酚的双加氧酶不属于同一酶系。 这些结果表明, 在PNP 代谢中诱导产生的替代PnpC功能的双加氧酶不是邻苯二酚双加氧酶,而是存在于DLL2E4基因组中的一个尚未发现的双加氧酶,且可能是与偏三苯酚1, 2 -双加氧酶功能类似的双加氧酶。 目前已发现恶臭假单菌还可用于降解水杨酸，烷烃，1-氯-4-硝基苯，化学农药等物质。

- 2 - 1080809095 应用微生物学进展 徐燕 2. 恶臭假单胞菌TS1138生物酶用于分解L-胱氨酸 L-半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸, 广泛应用于医药、食品、化妆品以及饲料工业[10]。目前, 工业上主要通过毛发酸水解生

产L-半胱氨酸。该工艺生产率低, 且产生大量刺激性气体和废酸造成环境污染[11]。另外,

由毛发水解法或其它方法获得的含半胱氨酸反应液, 由于其组成复杂[12], 并且半胱

氨酸在水中的溶解度较高[13], 所以要从复

杂的反应液中分离出高纯度的半胱氨酸是困难的。但半胱氨酸易被氧化成胱氨酸, 而胱氨酸在水中的溶解度极低[14], 通常利用

这一特性可将反应液中的半胱氨酸首先转化成胱氨酸, 沉淀析出, 然后再将分离出的胱氨酸电解还原成半胱氨酸[15], 从而可

获得半胱氨酸纯品。 自Sano[10,16]等发现嗜硫氮杂环戊烯假

单胞菌(Pseudomonas thiozolinophilum)能

够把DL-2-氨基- ∆2-噻唑啉-4-羧酸

(DL-2-Amino-∆2-thiazoline-4-carboxylic

Acid, DL-ATC)转化为L-半胱氨酸, 利用微生物酶法生产半胱氨酸已成为人们研究和关注的方向[16]。南开大学生命科学学院实验

室自行分离获得一株恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)TS1138, 并发现其具

有转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的能力[17]。本

研究对TS1138菌株转化生成的半胱氨酸后的氧化条件、分离纯化、产物鉴定以及酶源细胞的重复利用等方面进行了初步研究,

为微生物酶法制取L-胱氨酸和L-半胱氨酸的生产工艺奠定了基础。 实验基本过程如下： （1）对恶臭假单胞菌在产酶培养基上活化培养，再进行发酵培养，经离心，弃上清，加PBS 缓冲液重悬浮细胞制得酶源细胞菌悬液， （2）加入DL-ATC等底物，进行转化反应，生成L-半胱氨酸的转化液 （3）加入DMSO氧化L-半胱氨酸成为L-胱氨酸 （4）反应得到的含L-胱氨酸的液体经阳离子树脂柱吸附, 氨水洗脱, 收集洗脱峰, 然后HCl沉淀、洗涤、烘干后最终得到L-胱氨酸白色粉末, （5）取一定量上述条件所制备的L-胱氨酸粉末溶于HCl后, 采用高效液相色谱进行检测, 与标准品比对检测其纯度 (图2)。

图2 HPLC法检测转化液及纯化后的L-胱氨酸含量

A: DL-ATC和L-胱氨酸标准 B: TS1138转化液 C: 纯化后L-胱氨酸。色谱峰分别为 1: L-胱氨酸(保留时间5.371 min) 2: DL-ATC(保留时间6.285 min)

- 3 - 1080809095 应用微生物学进展 徐燕 2002年Shiba等报道了假单胞菌BS菌株由DL-ATC经酶法转化生成L-半胱氨酸是通过L-ATC水解酶水解ATC噻唑环中C2-S单键, 以N-氨甲酰-L-半胱氨酸(L-NCC)为转化的中间产物, 再经N-氨甲酰-L-半胱氨酸氨甲酰水解酶催化生成L-半胱氨酸的N-代途径(L-NCC途径)[10413。利用自行分离的恶臭假单胞菌TS1138, 我们已经进行了较为系统的酶学性质和功能基因研究 [18], 并证明其能通过L-ATC水解酶水解ATC噻唑环中的C=N双键, 生成S-氨甲酰-L-半胱氨酸(L-SCC)中间产物, 再经S-氨甲酰- L-半胱氨酸酰胺水解酶(L-SCC酰胺水解酶)催化生成终产物L-半胱氨酸, 为不同于N-代途径的S-代途径, 在转化机理的研究上取得了一定的进展[10，15]。 在此基础上, 本研究对以DL-ATC为出发原料最终制备L-胱氨酸的工艺条件进行了研究, 建立了以假单胞菌TS1138全细胞为酶源, 微生物酶法多次催化DL-ATC合成L-半胱氨酸, 并采用DMSO氧化水溶液中的半胱氨酸成胱氨酸, 进一步通过阳离子交换树脂分离纯化L-胱氨酸的生产工艺, 其收率达到78.55%, 纯度达到99.12%。通常在由酶催化法进行的反应中, 酶稳定性差、易失活, 一般不能重复使用, 而固定化的方法又或多或少对酶活力有一定影响。本方法简单高效, 有望为我国L-半胱氨酸和L-胱氨酸的生产开辟一条新途径。 3. 恶臭假单胞菌制剂在生物农药领域的应用 云南省烟草科学研究所发明一种恶臭

假单胞菌制剂，属微生物农药技术领域。该制剂由由生产菌株经发酵种子培养、发酵罐发酵后得到，步骤如下： （1）选用的生产菌株为恶臭假单胞菌（pseudomonas putida）

（2）种子培养：将Ｊ5接种到液体NA培养基上，在28－30℃温度下培养48ｈ获得发酵种子； （3）发酵罐发酵：将种子接种到装有牛肉膏0.5％、蛋白胨3％、氯化钠3％、Ｋ

【2】ＨＰＯ【4】１％、ｐＨ7－7.5、消泡剂0.1％，其余为水的发酵罐中，在温度29－30℃、搅拌速度120－150rpm、通气量5－10％、发酵时间45－48ｈ的条件下得到制剂。该制剂具有烟碱降解率高，并能够提高烟草的品质，可用于降解烟草或烟草废弃物中的烟碱。 上海交通大学国家微生物代谢重点实验室目前也通过从多种植物根部分离筛选到多株恶臭假单胞菌，其产生的次级代谢物对某些植物病原菌有较强的抗性作用。期望通过后期研究，能够对这些未知的抗生物质进行分离纯化鉴定，能够制成微生物制剂，应用到生物农药领域，为环境保护作出一定的贡献。 三、生物安全性

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