８４・　２ｏ１２年６月第６卷第１２期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）。Ｊｕｎｅ　１５．２０１２，Ｖｏ１．６．Ｎｏ．１２　

ＳＩＲＴ１对大鼠急性脊髓损伤炎症反应的影响　

王晓凯孙天胜李放张志成刘佳　

【摘要】　目的　观察大鼠急性脊髓损伤后ＳＩＲＴ１对局部组织炎症反应的影响。方法　采用改良　

Ａｌｌｅｎ　ｓ法，建立大鼠脊髓钝挫伤模型（Ｔ１０），１００只ＳＤ大鼠被随机分成４组：假手术组（／７，＝４，ＳＨＡＭ），模型组　

（ｎ＝３２，ＳＣＩ），白藜芦醇组（ｎ＝３２，ＲＥＳ），对照剂组（ｎ＝３２，ＳＯＬ）。脊髓损伤术后立即给予腹腔注射白藜芦　

醇（ＲＥＳ）１００　ｍｓ／ｋｇ和聚乙二醇硬脂酸酯１５（ＳＯＬ）１００　ｍｓ／ｋｇ，在脊髓损伤后４　ｈ，８　ｈ，２４　ｈ，３６　ｈ取材，用ＱＴ—　

ＰＣＲ的方法检测４组中ＳＩＲＴ１的动态表达情况，采用酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ试剂盒）测定脊髓损伤后４　ｈ，　

８　ｈ，１２　ｈ，２４　ｈ，３６　ｈ各组组织中炎症因子（ＩＬ－１Ｂ，ＩＬ－６，ＩＬ一１０，ＴＮＦ一　）水平。结果ＲＥＳ组ＳＩＲＴ１表达在４　ｈＮ　

显增加，在８　ｈ达到高峰，与其他两组（ＳＣＩ组，ＳＯＬ组）比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．Ｏ１）。ＳＣＩ组大鼠损伤　

脊髓组织在损伤后４　ｈ各炎症性细胞因子表达即明显升高，其中ＴＮＦ—ｏｔ和ＩＬ－６于损伤后８　ｈ达峰值，ＩＬ．１０在　

观察时间内呈持续性增高，ＩＬ一１Ｂ在２４　ｈ达峰值。ＳＯＬ组各炎症因子的变化规律与ＳＣＩ组基本一致，ＲＥＳ组　

与前两组相比，浓度差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。结论ＳＩＲＴ１对大鼠急性脊髓损伤后炎症反应有明显　

抑制作用。　【关键词】脊髓损伤；炎症；ＳＩＲＴ１　

Ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＳＩＲＴＩ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒａｔ　ａｃｕｔｅ　ｓｐｉｈａｌ　ｃｏｒｄ　ｉ　ｕｒｙ　ＷＡＮＧ　Ｘｉａｏ—ｋａｉ，ＳＵＮ　Ｔｉａｎ—　

ｓｈｅｎｇ，ＬＩ　Ｆａｎｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｚｈｉ—ｃｈｅｎｇ，ＬＩＵ　．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＯｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ　ａｎｄ　Ｔｒａｕｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆＢｅｉｆｉｎｇ　

Ｍｉｌｉｔａｒｙ　Ｒｅｇｉｏｎ，Ｂｅ　ｎｇ　１０００７０，Ｃｈｉｎａ　

Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：ＳＵＮ　Ｔｉａｎ—ｓｈｅｎｇ．Ｅｎｔａｉｌ：ｓｕｎｔｉａｎｓｈｅｎｇ一＠１６３．ｃｏｒｎ　

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＳＩＲＴ１　ｏｎ　ｔｈｅ　ｌｏｃａｌ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ｓｐｉｎａｌ　ｃｏｒｄ　ａｆｔｅｒ　

ａｃｕｔｅ　ｓｐｉｎａｌ　ｃｏｒｄ　ｉｎｊｕｒｙ（ＳＣＩ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ＳＣＩ　ｏｆ　ａｎｉｍａｌ　ｍｏｄｅｌ　ｗａｓ　ｍａｄｅ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ａｌｌｅｎ　ｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｎ　

Ｔ（１０）．Ｏｎｅ　ｈｕｎｄｒｅｄ　ＳＤ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ｆｏｕｒ　ｇｒｏｕｐｓ：ｓｈａｍ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ（／＇ｔ＝４），ＳＣＩ　ｇｒｏｕｐ（ｎ＝　

３２），ｒｅｓｖｅｒａｔｒｅｌ　ｇｒｏｕｐ（ｎ＝３２），ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（ｎ：３２）．Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ（１００　ｍｓ／ｋｇ）ａｎｄ　Ｓｏｌｕｔｏｌ（１００　ｍｓ／ｋｇ）ｗａｓ　ｇａｖｅ　

ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｂｙ　ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ＳＣＩ．Ｓａｍｐｌｅｓ　ｏｆｉｎｊｕｒｅｄ　ｓｐｉｎａｌ　ｃｏｒｄ　ｗｅｒｅ　ｔａｋｅｎ　ａｔ４　ｈ，８　ｈ，２４　ｈ，ａｎｄ　

３６　ｈ　ａｆｔｅｒ　ＳＣＩ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＩＲＴ１　ｗｅｒｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＲＴ－ＰＣＲ　ａｎｄ　ｗｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｄｙｎａｍｉｃ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒｓ（ＩＬ一１Ｂ，ＩＬ－６，ＩＬ—１０，ＴＮＦ—　）ｗｉｔｈ　ＥＬＩＳＡ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ａ　ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　

ＳＩＲＴＩ　ｌｅｖｅｌ　ａｔ　４　ｈｏｕｒｓ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｔｒａｕｍａ　ａｎｄ　ｉｔ　ｇｏｔ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｐｅａｋ　ａｔ　８　ｈ．Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｏｔｈｅｒ　ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ（ＳＣＩ　ｇｒｏｕｐ，　

ＳＯＬ　ｇｒｏｕｐ），ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＳＩＲＴ１　ｈａｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｄｉｆｅｒｅｎｃｅｓ（Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　

ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ　ａｔ　４　ｈ　ａｆｔｅｒ　ｔｒａｕｍａ　ｉｎ　ＳＣＩ　ｇｒｏｕｐ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ＩＬ－６　ｇｏｔ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｐｅａｋ　ａｔ　８　ｈ　ａｓ　

ｗｅｌｌ　ａｓ　ｒＮＦ—ｏｔ．Ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ　ｐｅａｋ　ｏｆ　ＩＬ一１　Ｂ　ｌｅｖｅｌ　ｗａｓ　ａｔ　２４　ｈ　ａｆｔｅｒ　ｔｒａｕｍａ．Ｂｕｔ　ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＩＬ－１０　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｂｙ　ｄｅｇｒｅｅｓ．　

Ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅ　ｒｕｌｅ　ｏｆ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｎ　ＳＯＬ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ａｇｒｅｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ＳＣＩ　ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｅｖｅｒｙ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　

ｃｙｔｏｋｉｎｅ　ｉｎ　ＲＥＳ　ｇｒｏｕｐ　ｈａｄ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｄｉｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｏｔｈｅｒ　ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＜０．Ｏ１）．　

Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　ＳＩＲＴ１　ｃａｎ　ｒｅｍａｒｋａｂｌｙ　ｒｅｐｒｅｓｓ　ｔｈｅ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ＳＣＩ．　

【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】　Ｓｐｉｎａｌ　ｃｏｒｄ　ｉｎｊｕｒｉｅｓ；　Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ；　ＳＩＲＴ１　

急性脊髓损伤（ａｃｕｔｅ　ｓｐｉｎａｌ　ｃｏｒｄ　ｉｎｊｕｒｙ，ａＳＣＩ）是致　

残的主要病因之一…，其病理生理过程包括原发损伤　

和继发损伤　。继发损伤最初会造成大量周围炎症细　

胞的募集，产生强烈的炎症反应，进而造成神经胶质细　

胞死亡　。　

ＤＯＩ：１０．３８７７／ｅｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４－０７８５．２０１２．１２．０２７　作者单位：１０００７０北京军区总医院全军创伤骨科研究所骨科（王　

晓凯、孙天胜、李放、张志成、刘佳）；山西医科大学研究生院（王晓凯）　通讯作者：孙天胜，Ｅｍａｉｌ：ｓｕｎｔｉａｎｓｈｅｎｇ一＠１６３．ｃｏｒｎ　・论著・　

沉默信息调节因子２（ｓｉｌｅｎｔ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　２，　

Ｓｉｒ２）相关酶，是一种高度保守的ＮＡＤ　依赖的蛋白去　

乙酰化酶　】。人类有７个Ｓｉｒ２同源基因：ＳＩＲＴ１—７　Ｌ６　Ｊ，　

其中ＳＩＲＴ１同源性最高　，近几年来成为研究热点。　

Ｙａｎｇ等Ｌ８　发现ＳＩＲＴ１蛋白具有抗炎抗氧化应激作用，　

可以减少细胞损伤。　

白藜芦醇（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏ，ＲＥＳ）是一种多酚类化合物，　

广泛存在于葡萄、花生等植物中　Ｊ。Ｂｅｃａｔｔｉ等　０＿证实　

了白藜芦醇能成功诱导ＳＩ

ＲＴ１过表达。由于白藜芦醇　２ｏ１２年６月第６卷第１２期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｆｉｎｉｃｉａｎｓ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｊｕｎｅ　１５，２０１２。Ｖｏ１．６。Ｎｏ．１２　

在水中溶解度较低，我们采用了ＢＡＳＦ公司研发的增溶　

剂Ｓｏｌｕｔｏｌ　ＨＳ　１５（ＳＯＬ），其为一种可有效提高药物溶解　

度的表面活性剂，已通过注射药物应用验证。　

有关ＳＩＲＴ１在ＳＣＩ炎症反应方面的研究尚未有报　

道，本研究采用大鼠急性脊髓钝挫伤模型，通过腹腔注　

射白藜芦醇过表达ＳＩＲＴ１＿１　，观察ＳＩＲＴ１对ＳＣＩ炎症　

反应的影响。　

材料与方法　

Ｉ．实验动物及分组：健康ｌ０周成年雌性ＳＤ大鼠　

１００只，平均２２０　ｇ，由中国人民解放军军事医学科学院　

动物所提供，大鼠购进后常规（同一条件下）饲养７　ｄ，　

观察其健康状况及四肢活动无异常后开始制作模型，　

随机分成４组：假手术（ＳＨＡＭ）组４只，模型（ＳＣＩ）组　

３２只，ＲＥＳ组３２只，ＳＯＬ组３２只。　

２．制作大鼠胸段脊髓定位损伤模型：根据Ｌｊｕ　

等　』的改良Ａｌｌｅｎ　Ｓ法：以１０　ｇ重锤，从２５　ｃｍ高空坠　

落，制作Ｔ１０脊髓节段钝挫伤，瞬间见大鼠Ｔ１０硬脊膜　

下血肿形成，并且呈对称分布，大鼠双后肢及尾部痉挛　

抽搐。术中避免损伤脊髓硬脊膜、血管和神经根，缝合　

皮肤前０．９％氯化钠注射液冲洗，严格止血，逐层缝合　

筋膜、皮肤，碘伏消毒伤口。　

３．术后处理：术后大鼠立即腹腔注射ＲＥＳ　

１００　ｍｇ／ｋｇ【１　和ＳＯＬ　１００　ｍｓ／ｋｇ，ＩＺｌ服补充生理盐水，单　

只分笼饲养，保持室温２５～３０℃，相对湿度４０％一　

７０％，每天观察３次并进行挤尿处理，观察伤口皮肤有　

无血肿、损伤或感染。术后皮下注射青霉素４０万Ｕ／　

次，２次／ｄ，连续３　ｄ。　

４．取材：室温条件下，给予大鼠腹腔注射１０％水　

合氯醛溶液，按体重０．３　ｍｌ／１００　ｇ麻醉成功后，仰卧位　

固定于操作台，打开胸腔显露心脏及纵隔血管，灌注针　

自心尖处插入升主动脉后夹紧固定，剪开右心耳放血。　

先用常温０．９％氯化钠注射液４００　ｍｌ快速冲洗清除洗　

净血管中血液，至右心耳流出液清亮为止。灌注过程中　

可见动物肢体及全身有肌肉抽搐，示灌注良好。按实验设　

计要求灌注完毕后取出脊髓长约１　ｃｍ，用于结果检测。　

５．ＰＣＲ检测：采用ＱＴ—ＰＣＲ方法半定量测定４组　

（ＳＨＡＭ，ＲＥＳ，ＳＯＬ，ｓｏ）脊髓组织中４　ｈ，８　ｈ，２４　ｈ，３６　ｈ　

各时间点ＳＩＲＴ１的动态表达。从ＮＢＣＩ　ＥＳＴ　Ｄａｔａｂａｓｅ　

中下载大鼠ＳＩＲＴ１　ＥＳＴ序列，用序列拼接软件Ｓｅｑｍａｎ　

将其拼接为一条较为完整的ＳＩＲＴ１序列，以此序列为　

模板，用Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ￣Ｓｏｆｔｗａｒｅ　ｖ３．０（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ—　

ｔｅｍｓ）设计ＰＣＲ引物，设定引物的Ｔｍ值在５９～６０℃，　

ＰＣＲ扩增片段大小在１００—１５０　ｂｐ。引物由北京天一　

辉远生物科技有限公司合成。引物Ｒａｔ—ＳＩＲＴ１一ＲＴ—　Ｆ１：序列：ＡＴＧＧＴＡ，Ｉ耵ＡＴＧｃＴＣＧＣＣ１ＴｒＧＣＴ，熔解温度　

５９　ｏＣ；Ｒａｔ—ＳＩＲＴ１一ＲＴ—Ｒ１：序歹Ⅱ：ＧＡＣＡＣＡＧＡＧＡＴＧＧＣＴ—　

ＧＧＡＡＣＴＧ，引物长度１５０　ｂｐ，熔解温度６０℃。内参为　

大鼠ＧＡＰＤＨ基因。最适循环数为４５个循环，循环条　

件：９５℃变性０．５　ｍｉｎ；７５　ｃＩ＝退火１　ｍｉｎ；６０　ｏＣ延伸　

０．３２　ｍｉｎ，４５个循环；用凝胶照相系统附带的分析软件　

对ＰＣＲ产物条带进行区带密度分析；计算目的基因　

（ＳＩＲＴ１）的区带与内参（大鼠ＧＡＰＤＨ基因）区带的密　

度比。　

６．ＥＬＩＳＡ检测：采用美国Ｒ＆Ｄ公司提供的ＥＬＩＳＡ　

试剂盒，检测４　ｈ，８　ｈ，２４　ｈ，３６　ｈ时间点各组的ＩＬ－１Ｂ、　

ＩＬ－６、ＩＬ　１０和ＴＮＦ一　的表达情况。切割标本后，称取重　

量（等重）。加入一定量的ＰＢＳ（ｐＨ　７．４），用手工或匀　

浆器将标本匀浆充分。离心２０　ｍｉｎ左右（２０００—３０００　

转／ｍｉｎ）。仔细收集上清。分装待检测，其余冷冻备　

用。步骤如下：先将标本和试剂盒取出在室温平衡　

１５～３０　ｍｉｎ，再按照说明书进行标准品的稀释与加样；　

温育：３７℃恒温箱，１５　ｍｉｎ；配液；洗涤：不少于５次；加　

酶；温育：３７　ｃＩ＝恒温箱，１　ｈ；洗涤；显色；终止；测定：测　

量各孔的吸光度（ＯＤ值）。以标准品的浓度为横坐标，　

ＯＤ值为纵坐标，计算出标准曲线的直线回归方程式，　

将样品的ＯＤ值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以　

稀释倍数，即为样品的实际浓度。　

７．统计学分析：所有数据以均数４－标准差（　４－ｓ）　

表示，采用ＳＰＳＳ　１７．０软件包进行处理，采用单因素方　

差分析进行组间比较，采用ＬＳＤ进行两两比较。Ｐ＜　

０．ｏ５为差异有统计学意义。　

结　果　

１．ＳＩＲＴ１的动态表达：ＰＣＲ产物大小在１００～　

１５０　ｂｐ。扩增效果较好，所有引物都可以成功地扩增出　

目的片段。ＲＥＳ组，ＳＣＩ组和ＳＯＬ组３组ＳＩＲＴ１的表达　

都有一定升高，与后两组相比，ＲＥＳ组ＳＩＲＴ１在４　ｈ，　

２４　ｈ，３６　ｈ表达升高比较明显，统计学比较差异有统计　

学意义（Ｐ＜０．０１），而且３组中ＳＩＲＴ１表达都在８　ｈ达　

到高峰，ＲＥＳ组较显著，与另外两组（ＳＣＩ，ＳＯＬ）比较差　

异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。除假手术组以外各组自　

８　ｈ后ＳＩＲＴ１表达下降。见表１。　

表１各组各时间点ＳＩＲＴ１的动态表达（元±５）　

组别　ｎ　４　ｈ　８　ｈ　２４　ｈ　３６　ｈ　

ＳＨＡＭ组４　０．１０　０．１０　０．１０　０．１０　

ＳＣＩ组３２　０．２９±０．０２　０．３４±０．０６　０．１９±０．０２　０．１４　４－０．０６　

ＲＥＳ组３２　１．４６±Ｏ．０５ａｂ　２．６７±０．０４ａｂ　２．２４±０．０３且ｂ　１．０２±Ｏ．０１ａｂ　

ＳＯＬ组３２　０．２５±０．０１　０．３０±０．０３　０．２１±０．０１　０．１５　４－０．０５　

注：与ＳＣＩ组相比，。Ｐ＜Ｏ．０１；与ＳＯＬ组相比，　Ｐ＜０．Ｏ１