生物质中纤维素、半纤维素和木质素含量的测定

一 实验目的

1. 掌握生物质中主要化学成分含量的经典分析方法和原理。

2. 了解纤维素、半纤维素以及木质素这三种主要化学成分在生物质热裂解中的作用。

二 实验原理

植物的主要化学成分是纤维素、半纤维素和木质素这三部分。它们是构成植物细胞壁的主要组分。其中，纤维素组成微细纤维，构成纤维细胞壁的网状骨架，而半纤维素和木质素是填充在纤维和微细纤维之间的“粘合剂”和“填充剂”。

1. 纤维素

生物质粉末在加热的情况下用醋酸和硝酸的混合液处理，在这种情况下，细胞间的物质被溶解，纤维素也分解成单个的纤维，木质素、半纤维素和其它的物质也被除去。淀粉、多缩戊糖和其它物质受到了水解。用水洗涤除去杂质以后，纤维素在硫酸存在下被重铬酸钾氧化成二氧化碳和水。

C6H10O5 + 4K2Cr2O7 + 16H2SO4 = 6CO2 + 4Cr2(SO4)3 + 4K2SO4 + 21H2O

过剩的重铬酸钾用硫酸亚铁铵溶液滴定，再用硫酸亚铁铵滴定同量的但是未与纤维素反应的重铬酸钾，根据差值可以求得纤维素的含量。

K2Cr2O7 + 6FeSO4+ 7H2SO4 = 3 Fe2(SO4)3 + Cr2(SO4)3 + K2SO4 + 7H2O

2. 半纤维素

用沸腾的80％硝酸钙溶液使淀粉溶解，同时将干扰测定半纤维素的溶于水的其它碳水化合物除掉。将沉淀用蒸馏水冲洗以后，用较高浓度的盐酸，大大缩短半纤维素的水解时间，水解得到的糖溶液，稀释到一定体积，用氢氧化钠溶液中和，其中的总糖量用铜碘法测定。

铜碘法原理：半纤维素水解后生成的糖在碱性环境和加热的情况下将二价铜还原成一价铜，一价铜以Cu2O的形式沉淀出来。用碘量法测定Cu2O的量，从而计算出半纤维素的含量。

测定还原性糖的铜碱试剂中含有KIO3和KI，它们在酸性条件下会发生反应，也不会干扰糖和铜离子的反应。加入酸以后，会发生反应释放出碘：

KIO3 + 5KI +3H2SO4 = 3I2 + 3K2SO4 +3H2O

加入草酸以后，碘与氧化亚铜发生反应：

Cu2O + I2 + H2C2O4 = CuC2O4 + CuI2 + H2O

过剩的碘用Na2S2O3溶液滴定：2Na2S2O3 + I2 = Na2S4O6 + 2NaI

3. 木质素

先用1％的醋酸处理以分离出糖、有机酸和其它可溶性化合物。然后用丙酮处理，分离叶绿素、拟脂、脂肪和其它脂溶性化合物。将沉淀用蒸馏水洗涤以后，在硫酸存在下，用重铬酸钾氧化水解产物中的木质素：

C11H12O4 + 8K2Cr2O7 + 32H2SO4 = 11CO2 + 8K2SO4 + 8Cr2(SO4)3 + 32H2O

过量的重铬酸钾用硫酸亚铁铵溶液滴定。方法和测定纤维素相同。

三 实验所需试剂和仪器

1. 实验试剂

硫酸亚铁铵 分析纯， 重铬酸钾 分析纯， 硫代硫酸钠 分析纯，

硝酸钙 分析纯， 硫酸铜 分析纯， 碘化钾 分析纯，

可溶性淀粉 分析纯， 氯化钡 分析纯， 邻菲啰啉 分析纯， 丙酮 分析纯， 碘酸钾 分析纯， 草酸 分析纯，

酒石酸 分析纯， 浓硫酸 分析纯， 盐酸 分析纯，

冰醋酸 分析纯， 硝酸 分析纯， 酚酞

2. 所需仪器

50mL酸式滴定管，50mL碱式滴定管，10mL离心试管若干支，不同型号烧杯若干个，250mL锥形瓶若干个，电炉，离心沉淀器。

四 实验步骤

（一） 纤维素含量的测定(需时5-6 h)

1. 所需溶液

硝酸和醋酸的混合液，0.5N硫酸-重铬酸钾溶液，试亚铁灵指示剂

浓硫酸，0.1N莫尔氏盐溶液，0.1N重铬酸钾溶液。

2. 实验步骤

（1） 配制所需的各种溶液，0.1N莫尔氏盐溶液在使用的一周内准备，并在使用当天测定其滴定度K。测定办法：取25mL 0.1000N（精确到小数点后四位，真实浓度设为c N）的重铬酸钾溶液，加入5ml浓硫酸和3-5滴试亚铁灵试剂，用该莫尔氏盐溶液滴定，用去m mL。

K= 25 × c / m

（2） 称取自然风干的生物质粉末0.05-0.06g，数值为n

（3） 装入离心管内，加入硝酸和醋酸的混合液5 mL

（4） 塞住离心管，在沸水中煮沸25 min，并定期搅拌

（5） 离心，滗去清液，加入蒸馏水离心洗涤沉淀，共洗三次（10ml×3）

（6） 沉淀中加入10 mL 0.5 N的硫酸-重铬酸钾溶液，沉淀溶解。搅匀，放入开水中10 min，并定期搅拌

（7） 冷却，倒入洁净的250ml锥形瓶中，用少许蒸馏水（约10-15ml）冲洗沉淀，洗涤液合并到锥形瓶中溶液，冷却后滴入3滴试亚铁灵试剂，用0.1N莫尔氏盐溶液滴定，用去b mL，由黄色经黄绿色至红褐色为终点

（8） 对照试验： 取10 mL 0.5N硫酸-重铬酸钾溶液，稀释至15ml，冷却后滴入3滴试亚铁灵试剂，用0.1N莫尔氏盐溶液单独滴定，用去a mL

（9） 生物质中纤维素的含量计算公式

x% = 0.00675×K（a－b）/n ×100%

x%：纤维素含量；K：莫尔氏盐滴定度；a：滴定10ml 0.5N硫酸-重铬酸钾对照液所耗0.1N莫尔氏盐溶液的体积；b：纤维素测定所耗0.1N莫尔氏盐溶液的体积；n：分析材料样品重（g）；0.00675：纤维素的标准滴定度

（二）半纤维素含量的测定(需时7-8 h)

1. 所需溶液

80%硝酸钙溶液，2 N盐酸，酚酞指示剂，2 N氢氧化钠溶液，碱性铜试剂

草酸-硫酸混合液，0.5%淀粉，0.01 N硫代硫酸钠溶液。

2. 实验步骤

（1） 称取自然风干的生物质粉末0.1-0.2g，数值为n （2） 装入小烧杯中，加入15 mL 80%的硝酸钙溶液，盖好烧杯，加热至沸腾，在慢慢沸腾的情况下加热5 min

（3） 微沸加热结束后，加入20ml 蒸馏水并洗涤烧杯盖。分步离心，分别用10 mL热水洗涤沉淀三次（10ml×3）

（4） 在沉淀中加入10 mL 2 N的盐酸，搅匀，沸水浴中搅拌情况下微沸45 min，使半纤维素水解完全

（5） 离心，残渣分别用10 mL蒸馏水冲洗三次（10ml×3），冲洗后的水溶液合并在先前的酸性离心液中

（6） 在第（5）步所得溶液中加入1滴酚酞，用2 N氢氧化钠溶液中和到显橙红色

（7） 烧杯溶液充分转入100 mL的容量瓶，稀释到刻度

（8） 用干燥滤纸过滤到干燥烧杯中，最初滤出的少量溶液抛弃

（9） 用移液管吸取10 mL滤液到大试管中，加入10 mL碱性铜试剂，盖好试管盖，在沸水中煮15 min

（10） 冷却，在不断搅拌下逐渐加入5 mL草酸-硫酸混合液，加入0.5 mL 0.5%淀粉，用0.01

N硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失，用去b mL

（11） 对照试验：取10 mL碱性铜试剂，加5mL草酸-硫酸混合液，再加未煮的10 mL滤液，加入0.5 mL 0.5%的淀粉，0.01 N硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失，用去a mL

（12） 生物质中半纤维素的含量计算公式

x% = 0.009×100 [ 248－（a－b）]（a－b）/10000×10×n×100%

x%：半纤维素含量；n：分析材料样品重（g）；a：滴定对照液所耗0.01 N硫代硫酸钠溶液的体积（ml）；b：滴定分析液所耗0.01 N硫代硫酸钠溶液的体积（ml）；0.009：己糖换算为纤维素的系数

（三）木质素含量的测定(需时23-24 h)

1. 所需溶液

1%醋酸，丙酮，73%硫酸，10%氯化钡溶液，0.5 N硫酸-重铬酸钾溶液

0.1N莫尔氏盐溶液，试亚铁灵指示剂。

2. 实验步骤

（1） 标定新配的0.1 N硫酸亚铁铵溶液, 滴定度为K

（2） 称取自然风干的生物质粉末0.05-0.1g，数值为n

（3） 生物质粉末装入离心管，加入10 mL 1％醋酸，摇动5 min混匀

（4） 离心，滗出上层清液。沉淀用5 mL 1％醋酸浸泡洗涤，离心，滗出上层清液

（5） 加丙酮3-4 mL，在摇荡的情况下浸泡3 min，洗三次（3-4 mL×3）

（6） 用玻璃棒将沉淀沿管壁充分分散开，将离心管置于沸水中使沉淀充分干燥，要特别注意防止沉淀跳溅出管外

（7） 在干燥沉淀中加入73％硫酸3 mL，用玻璃棒搅匀，挤压成均匀的浆液

（8） 室温下放置一夜（约16h），使纤维素溶解彻底

（9） 离心管中加入10 mL蒸馏水，搅匀，置沸水中5 min

（10） 冷却，加入0.5 mL 10%氯化钡溶液，搅匀，离心，滗出上层清液，分别用10 mL蒸馏水冲洗沉淀两次，每次要混匀（10mL×2）

（11） 沉淀中加入10 mL 0.5 N硫酸-重铬酸钾溶液，放入沸水不时搅拌15 min

（12） 冷却，将离心管中内容物全部转入锥形瓶中，用少许蒸馏水（10-15ml）冲洗沉淀，冲洗液合并入锥形瓶中，滴入3滴试亚铁灵试剂，用0.1N莫尔氏盐溶液滴定，用去b mL，由黄色经黄绿色至红褐色为终点

（13） 对照试验：以试亚铁灵试剂为指示剂，用0.1N莫尔氏盐溶液单独滴定10 mL 0.5 N硫酸-重铬酸钾溶液，用去a mL

（14） 生物质中木质素的含量计算公式

x% = 0.00433×K（a－b）/n×100%

x%：木质素含量；K：莫尔氏盐滴定度；a：滴定10ml 0.5N硫酸-重铬酸钾对照液所耗0.1N莫尔氏盐溶液的体积；b：木质素测定所耗0.1N莫尔氏盐溶液的体积；n：分析材料样品重（g）；0.433：木质素的标准滴定度

附：溶液配制：

A．110mL硝酸和醋酸的混合液：取10ml比重为1.4（质量分数约为70％）的硝酸加入到100ml

80% 的醋酸中，充分混合，保存于磨口玻璃瓶中。《需要质量分数70％的硝酸10mL、冰醋酸80mL、二次水20mL、100mL或以上的磨口玻璃广/细口瓶1个》《公用：250mL烧杯1个、10mL或者25mL的量筒1个、100mL的量杯1个、玻璃棒1个》《测定一个生物质样品需要mL》。

B．1050mL 0.5N硫酸-重铬酸钾溶液：准确称取重铬酸钾（化学纯）25g（精确到0.01g），溶解于250ml蒸馏水中，装入容积不小于2L 的烧瓶中。在冰水浴的条件下，逐渐加入800

ml比重为1.84（质量分数约为97－98％）的浓硫酸，仔细混匀，充分摇振溶解。冷凉后装入磨口玻璃瓶中，保存于暗处。《需要重铬酸钾（化学纯）25g、浓硫酸800mL、二次水250mL、2L的磨口玻璃圆底烧瓶1个（带磨口瓶塞）》《公用：冰、耐酸碱手套1付、天平、水盆1个、800mL以上的量杯1个》《防硫酸腐蚀》《测定一个生物质样品需要mL》

C．100mL 试亚铁灵指示剂： 称取1.458g 邻菲啰啉(C12H8N2·H2O，1,10-phenanthroline)，0.695g 硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）溶解于水中，稀释至100ml，贮存于棕色瓶内。《需要邻菲啰啉1.5g、七水合硫酸亚铁1g、二次水100mL、100mL 棕色瓶细口瓶1个（带胶头滴管）》《公用：100mL或者250mL的烧杯1个、100ml容量瓶1个、玻璃棒1个、胶头滴管1个、》《测定一个生物质样品需要mL》

D．1L 0.1N莫尔氏盐溶液（硫酸-硫酸亚铁铵溶液）：称取40g莫尔氏盐（硫酸亚铁铵，FeSO4·(NH4)2SO4·6H2O），溶解于蒸馏水中，加入20ml 浓硫酸，用蒸馏水稀释到1L，混匀。该溶液需在使用前的一周内准备，并在使用当天测定其滴定度。《需要硫酸亚铁铵40g、浓硫酸20mL、二次水1000mL、1L的容量瓶1个、》《公用：250mL的烧杯1个、10mL或者25mL的量筒1个、玻璃棒1个、胶头滴管1个、》《防硫酸腐蚀，现用现配》《测定一个生物质样品需要mL》

E．1L 0.1N重铬酸钾溶液：准确称取重铬酸钾（化学纯）4.9035g，溶解于水中，转移至1L的容量瓶中，加水至刻度，仔细混匀。《需要重铬酸钾（化学纯）5g、二次水1000mL、1L的容量瓶1个、》《公用：250mL的烧杯1个、天平、胶头滴管1个、玻璃棒1个》《测定一个生物质样品需要mL》

F．250mL 80% 硝酸钙溶液：用粗天平称取200g硝酸钙（Ca(NO3)2·4H2O），置于烧杯中，用70ml 蒸馏水溶解（不溶可稍加热溶解），用水将溶液体积补充到250ml，混匀。《需要硝酸钙200g、二次水250mL、250mL的容量瓶1个、》《公用：250mL的烧杯1个、天平、胶头滴管1个、玻璃棒1个、电炉》《测定一个生物质样品需要mL》

G．1L 2 N盐酸：吸取比重为1.19（质量浓度38.3％）的盐酸167ml于1L的容量瓶中，用蒸馏水稀释到刻度，混匀。《需要浓盐酸170mL、二次水850mL、1L的容量瓶1个、》《公用：200mL以上的量杯1个、胶头滴管1个》《测定一个生物质样品需要mL》

H．1L 2 N氢氧化钠溶液：用粗天平称取80g分析纯的氢氧化钠，溶解于1L蒸馏水中，加热