浆细胞疾病免疫表型分析苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所卫生部血栓与止血重点实验室朱明清浆细胞疾病分类•多发性骨髓瘤（MM)•其它疾病•Monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS)•冒烟型骨髓瘤 (SMM)•孤立性浆细胞瘤»骨»髓外•原发巨球蛋白血症•原发淀粉样变性(AL)•重链病•POEMS 综合征/ 骨硬化性骨髓瘤 • I 和 II 型冷球蛋白血症 •轻链沉积病多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM ）是恶性浆细胞病中最常见的一种类型，又称骨髓瘤,是B细胞起源的，骨髓克隆性浆细胞恶性增殖和异常积累，并伴大量单克隆免疫球蛋白的出现及沉积为特征的一种衰竭性、不可治愈的恶性疾病。
多发性骨髓瘤常伴有多发性溶骨性损害,高钙血症,贫血,肾脏损害,而且对细菌性感染的易感性增高,正常免疫球蛋白的生成受抑。
临床表现复杂多样，无特异性，误诊率高达84%-85%。
多发性骨髓瘤发病概况临床表现•骨髓中异常浆细胞：骨质破坏（骨痛，骨折，高钙血症） 贫血（头晕乏力） 产生大量的异常蛋白正常免疫球蛋白产生减少•异常蛋白质：血液粘滞度增高（头晕，手足麻木）蛋白尿肾功能不全淀粉样变•正常免疫球蛋白减少：反复感染•高钙血症：乏力，恶心，呕吐，神智异常，影响肾功能•淀粉样变：可以影响全身各个器官，主要为肾脏，心脏以及消化道等球蛋白异常：增高或减低 蛋白尿 单克隆免疫球蛋白多发性骨髓瘤的诊断步骤单克隆免疫球蛋白的鉴定血清蛋白电泳血清和尿免疫固定电泳24小时尿轻链定量血清游离轻链定量及比例骨髓穿刺和活检组织活检免疫表型、证实克隆性浆细胞IgH/L 基因重排骨髓瘤相关器官损害评估血常规生化检查：血清肌肝和血钙骨骼检查浆细胞单克隆属性骨髓瘤相关器官损害蛋白水平细胞及基因水平多发性骨髓瘤的诊断步骤特殊检查•腹壁脂肪或直肠粘膜活检•孤立性溶骨病灶活检•血粘度测定•免疫固定电泳（针对IgD 或IgE ）•寡分泌型患者的MRI 、PET 检查检查优点局限骨髓穿刺涂片简便瘤细胞不均一性骨髓活检反映侵犯程度疼痛SPE/UPE 简便敏感性: 0.2-0.6 g/L IFE 敏感性: 0.12–0.25g/L 非定量sFLC 敏感性：10mg/L 费用较IFE 贵骨髓免疫组化识别克隆性浆细胞/形态学实验室要求高骨髓FCM 识别克隆性浆细胞实验室要求高MRI, PET检测全身状况及不分泌肿瘤价格贵MM各种检查方法的比较2014 IMWG （国际骨髓瘤工作组）更新的骨髓瘤诊断标准MGUS▪M 蛋白 < 3 g/dL▪骨髓瘤克隆性浆细胞 < 10%▪无骨髓瘤确定性事件冒烟型骨髓瘤▪M 蛋白 ≥ 3 g/dL (血清) or ≥ 500 mg/24 hrs (尿)▪骨髓中克隆性浆细胞≥ 10% to 60%▪无骨髓瘤确定性事件多发性骨髓瘤▪浆细胞增生性疾病▪AND 1个或多个骨髓瘤确定性事件▪≥ 1 CRAB* 症状▪骨髓克隆性浆细胞 ≥ 60%▪血清游离轻链 ≥ 100▪ > 1 MRI 局限性损害*C: 血清钙升高 (> 11 mg/dL or 大于正常值上限1 mg/dL)R: 肾功能不全 (肌酐清除率< 40 mL/min or 血清肌酐> 2 mg/dL)A: 贫血 (Hb < 10 g/dL or 2 g/dL < 正常值)B: 骨病 (≥ 1 溶骨性损害，X 光片, CT, or PET-CT)Lancet Oncol 2014; 15: e538–48MM的实验室诊断骨髓象检查对诊断本病具有决定性意义。
骨髓常增生活跃，骨髓瘤细胞一般都在5％以上，多者可达９５％。
瘤细胞有时呈不均匀分布，须多部位多次骨穿方能确诊。
多发性骨髓瘤细胞形态特点①细胞大小不一，有时可见巨型、多枚骨髓瘤细胞；②核染色质细致，有１～2个核仁；③胞浆着色异常，部分呈嗜碱性，部分呈嗜酸性，有时胞浆内见红色或结晶状包涵体即罗氏小体。
核周围淡染区常不明显或消失，可合少量嗜苯胺蓝颗粒或空泡。
有时可见蓝色小球状，直径约２ｕ的充满胞浆的包涵体。
Flow cytometry of a bone marrow aspirate can permit assessment of plasma cell phenotype, confirm clonality and permit determination of the proportion in cell cycle (plasma cell labelling index ). It is important to assess abnormalphenotype and clonality when the bone marrow plasma cells are <10%. Identification of an abnormal and unique plasma cell phenotype may be of value for later response evaluation.Guidelines on the diagnosis and management of multipleMyeloma. British Journal of Haematology, 132, 410–451流式免疫分析对MM 诊断的意义细胞类型鉴定Borowitz et al (1993) AJCP 100:534-40.Steltzer et al (1993) Ann NY Acad Sci 667:265-280B淋巴细胞分化与抗原表达关系图Wood and Borowitz (2006) Henry’s Laboratory Medicine CD45/SS示意图正常骨髓细胞血液肿瘤细胞老化粒细胞、噬酸细胞早幼—成熟粒细胞M3、CML单核细胞M4、M5LGL淋巴细胞CLL、ALL、CLD正常前体细胞 M0、M1、M2、M4、M5、ALL成熟红细胞、血小板 M6、M7、MM细胞碎片Pre-B-ALL非血液来源细胞MM细胞的免疫表型MM细胞的免疫表型正常浆细胞-群体异质性较大CD19CD81CD45CD20CD56特异性50%100%59%91%74%敏感性100%95%90%34%69%Leuk Res 2014,38(3):371-376•正常浆细胞：CD138+, CD38++, CD79a+,CD27+,CIg+, SIg-, CD19(>75%+), CD45+ ,CD56–, CD20–, CD28–, CD33–, CD117–,胞浆κ/λ正常•MM 细胞: CD138+,CD38++, CD79a+, CD27(40-50%+),CIg+, SIg-, CD56(75%++), CD117(30%+), CD20(30%+), CD10-/+, CD19–, 胞浆κ/λ异常•联合CD38/CD56/CD19/CD45能鉴别出90％以上MM 的瘤细胞和正常浆细胞MM细胞免疫表型及轻链限制性表达MM 病例正常浆细胞MM 表面标记克隆性鉴定治疗过程中发生免疫表型变异CD56转阳治疗前治疗后CD20转阳CD52转阳MM 克隆演变恶性浆细胞的异质性•Lack of CD56 expression was reported to be associated with a poor prognosis in multiple myeloma (MM) patients treated with conventional chemotherapy.•Lack of CD56 expression on myeloma cells is not a marker for poor prognosis in patients treated by high-dose chemotherapy and is associated with translocation t(11;14) Bone MarrowTransplant. 2007;40(11):1033-7免疫表型与预后的关系新的浆细胞疾病相关免疫分子探索MM完全缓解的一般标准是骨髓浆细胞小于5%，血和尿中M蛋白消失，但大多数患者最终难免复发。
传统的形态学检测和血、尿蛋白电泳等方法在分析MRD有一定的局限性。
在检测MRD的多种方法中，形态学是最普遍、最基础的检测手段，有助于疾病的诊断，在一定程度上可反映治疗的效果。
但骨髓瘤细胞在骨髓中呈灶性分布，穿刺所得标本不一定能反映骨髓真实情况，且形态学上不易与正常浆细胞区分，也难以反映缓解期内肿瘤负荷的变化，且灵敏度仅能达到5x10-2。
血、尿蛋白电泳可间接反映肿瘤负荷量，但特异性较低，敏感度也不高。
MRD in Multiple MyelomaMM是浆细胞异常增生性疾病。
大部分正常浆细胞为CD138+/CD38++/CD19+/CD56-/CD117-/CD20-CD27+/CD81+/CD45dim/cyκ轻链/cyλ轻链多克隆分布，使用CD138/CD38双标记检测外周血和骨髓标本，可以准确划定浆细胞群。
CD138/CD38/CD19/CD56/CD117/CD45（82%）对外周血或骨髓标本进行多参数分析，可计算异常浆细胞含量，灵敏度达10-4。
对于多发性骨髓瘤的诊断和治疗评估具有重要意义。
联合MM病人cyκ轻链/cyλ轻链单克隆分布或DNA异倍体检测可适用于100%MM的MRD监测，灵敏度达10-5。
MRD in Multiple MyelomaIMWG 引入新的反应标准•Stringent complete response (sCR)†Absence of clonal PCs by immunohistochemistry or 2- to 4-color flow cytometry•Immunophenotypic CRAbsence of phenotypically aberrant PCs (clonal) in BM with a minimum of 1 million total BM cells analyzed by multiparametric flow cytometry (with > 4 colors)Blood 2011 117: 4691-4695Blood. 2015;125(12):1932-1935流式细胞术检测多发性骨髓瘤的残留病水平是PFS 和OS 的独立预后因素。