小鼠骨髓细胞群细胞系的建立
一、实验目的：
1) 通过培养小鼠骨髓基质细胞，建立小鼠骨髓基质细胞系 2) 了解细胞培养的一般步骤和注
意事项，培养无菌操作意识
二、实验原理：
细胞培养：多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老和死亡的细胞。
移植到体外后，只要条件适合，依然保持着分裂增殖的能力。利用这个原理,将小鼠骨髓基
质细胞移植到体外培养。通过一定的纯化方法，从原代细胞得到传代细胞，经过若干代中，
部分细胞发生遗传物质的变化成为无限传代的性质，分离得到细胞系。
培养细胞纯化：由于上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，成纤维细胞先脱壁，
利用此道理，采用多次差别消化法将上皮细胞核成纤维细胞分离而达到纯化的目的
三、材料：实验小白鼠
四、药剂及配制：
五、仪器器材：
（1）培养皿×3、500ml烧杯×1、棉花、医用解剖器材（剪刀、镊子、解剖刀）、10ml注
射器、4号针头、离心管若干、三角瓶若干、25ml卡式瓶若干、滴管、精密pH试纸、0.22
μm微孔滤膜、血球细胞计数板、标签纸、油性笔、冻存管 （2）超净工作台、CO2培养箱、
高速离心机、高压灭菌锅、显微镜、水浴锅、-86℃冰箱
2、无菌工作室及其内物品的消毒灭菌 （1）超净工作台
检查超净工作台是否正常；用之前用沾了75%酒精的脱脂棉擦拭，再开30min的紫外照射 （2）
小件物品
用牛皮纸（报纸）将小件物品(如镊子、解剖刀等)包裹好放进饭盒里，放进灭菌锅，其他物
品也一并放入蒸汽灭菌锅内，95KPa、121℃下灭菌30min （3）其他仪器灭菌 3、试剂配制
（如上表） 4、器材准备 5、注意：
1) 使用高压灭菌锅时注意正确使用方法，以免引起危险 2) 超净工作室和工作台必须清理干
净，以免引起细胞污染
浸泡
•用5%的盐酸溶液浸泡过夜
刷洗
•用足量的洗衣粉反复刷洗,将瓶壁上的残渍洗干净
浸酸
•将干燥后的器皿用重络酸钾溶液(重络酸钾120g:浓硫酸200ml:蒸馏水
1L)浸泡过夜
冲洗
•将浸酸后的玻璃器皿用自来水冲洗,然后用蒸馏水,最后干燥、待用
第二部分 原代培养
器材：解剖刀、剪刀、镊子、平皿、注射器、离心机、血球计数板、15ml离心管×4、培养
瓶×2，冰块
试剂：乙醚、D-Hank’s溶液、生理盐水 仪器：超净工作台、离心机、显微镜 步骤： 1.取
样
1) 超净工作台上的物品：灭菌后的解剖刀、剪刀、镊子、注射器、平皿、冰块 2) 将小鼠用
乙醚麻醉后引颈处死（用培养皿盛），在盛有75%酒精的烧杯中浸
泡5min。在超净工作台上分离双侧股骨（培养皿下置冰块），在含生理盐水的50mm2玻璃
平皿中去除股骨周围肌肉组织（皿下置冰块）。
3) 剪去骺端。用10mL注射器抽取食量D-Hank’s液冲洗骨髓腔，将骨髓冲入
培养瓶。
4) 用4号针头反复吹打骨髓细胞悬液，制成单细胞悬液,，盛在离心管里。 5) 将悬液在
1000r/min下离心5min后收集细胞 2.原代培养
1) 取出部分细胞用显微镜计数【附：血球计数板计数法】 2) 以1×108/ml细胞密度接种在
25cm2卡式瓶中，加血清培养基 3) 在饱和湿度下 5% CO2 37℃恒温培养箱中培养。 3、注意：
1) 超净工作台上操作的基本规范； 2) 离心机的使用方法；
第三部分 传代培养
器材：卡式瓶若干、滴管、洗耳球、移液管 试剂：D-Hank’s液、胰蛋白酶液、EDTA液 材
料：生长良好的原代培养细胞 步骤：
1、从培养箱中取出培养五天后的培养瓶，用滴管吸掉旧培养液
2、用D-Hank’s液洗涤细胞1或2次，洗去血清和活力弱的细胞【在培养瓶中滴加BSS，
直接倾倒，重复即可】
3、用胰蛋白酶-EDTA液（1:1）消化分散贴壁细胞【加入消化液，37℃，数分钟（看情况而
定，显微镜下细胞将要分离呈现圆粒状即可）】
4、加适量含血清的培养液终止消化作用，离心去上清液，加D-Hank’s液洗涤1-2次
5、轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入培养基，吹打混匀。按比例稀释后接种到新的培养
瓶中培养。
第四部分 纯化
器材及仪器：吸管、离心管、培养瓶、显微镜、离心机 试剂：培养基、胰蛋白酶液、EDTA
液 材料：生长良好的传代培养细胞 步骤：
1) 取出细胞培养瓶，用0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA液混合漂洗细胞，摇动，
用显微镜观察，等到差不多半数细胞脱落后，停止消化
2) 将消化液用吸管吸出到离心管中，离心去上清，沉淀的细胞转入新培养瓶中，
加培养液培养 3) 原瓶加液继续培养
注意：各步骤均在无菌工作室内进行
第五部分 冻存和复苏
试剂：培养基、20%DMSO、台盼蓝
器材：冻存管、血球计数板、离心管、试管、培养瓶、吸管 仪器：-86℃冰箱、离心机、显
微镜、水浴锅 步骤：
1. 离心用试管收集对数生长期的纯化培养细胞（如果不是，可更换培养瓶里的
培养基，培养24h），加血清培养基，重悬起细胞 2. 取0.1mL细胞计数，计算细胞浓度及冻
前存活率
3. 冻存液的配制：取离心管，加入血清培养基，逐滴加入DMSO至20%；用
前配制，待置室温下
4. 取冻存液缓慢逐滴加入细胞悬液中，边加变轻微摇动，至DMSO浓度成10%
止，细胞浓度1~5×106个/mL，混匀，分装到冻存管中，标记；留少量做污染检测
5. 冻存：先将冻存管置于4℃10min，调节冰箱，-20℃30min，-80℃18h；有条
件的可以将冻存管放到液氮槽中长期储存 6. 复苏：
1) 将取出的冻存管迅速投入37~40℃水浴中，振荡；
2) 将细胞液吸出到培养瓶中，加培养液离心洗涤1-2次，除去冻存保护剂； 3) 将培养液细
胞浓度调整到1×105-2×105个/mL，常规培养
注意事项：慢冻快苏原理；冻存管若是安培瓶或无螺帽冻存管，小心冻存管爆裂，若是非螺
旋盖冻存管，应注意防止水进入而造成污染
附1：细胞计数法
实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即
可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。 具体操作：
①盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。
②制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到离心管中，加入5滴台盼蓝，活细胞不
会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。 ③将细胞悬液滴入计数板：
将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，
注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
④统计4个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看
到镜中出现计数方格后，数出四角的4个大铬（每个大格含有16个中格）中没有被染液染
上色的细胞数目。
⑤计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度： （细胞悬液的细胞数）/mL＝（4
个大格子细胞数/4)×2×104 说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。 公式中乘
以2因为细胞悬液于染液是1：1稀释。 公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：
1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1mL＝1000mm3 细胞计数要点：
①进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于1×107 L-1，如果细胞数目很少要进行离心
再悬浮于少量培养液中。
②要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。
③取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，
以求计数准确。
④数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照1个细胞计算。如果细胞压
在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。
⑤操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。
初学者易犯的错误： 计数前未将待测悬液吹打均匀。滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。
滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。