羔羊超数排卵研究进展

1 超数排卵的作用机理

超数排卵，即指在雌性动物发情周期的适当时间，注射外源激素，从而使血液中促性腺激素浓度升高，使卵巢上更多的卵泡发育并排卵。

自然条件下，雌性动物卵巢中含有大约300，000 个左右的卵泡，但自然情况下仅有1%能发育成熟而排卵，约有99%的卵泡会发生闭锁退化。卵泡是位于卵巢生殖上皮、包裹卵母细胞或卵子的特殊结构。卵泡细胞分为初级卵泡，次级卵泡和成熟卵泡。卵泡细胞从初级卵泡开始到发育为成熟卵泡时要经历三个不同的发育阶段，即征集、选择及优势化阶段。征集阶段是指生长卵泡池中一群小卵泡开始迅速生长，引起此现象发生的主要因素是因为卵泡发育受到激素FSH 的调控。选择阶段是指只有部分被征集的卵泡继续发育，以至最终确立优势卵泡的过程。优势化阶段是指优势卵泡迅速发育而其它同时被征集的卵泡生长和发育受到移植。这主要是因为发育起来的较大的卵泡能够分泌大量的雌二醇和抑制素，然后又可通过负反馈抑制垂体分泌FSH，从而使FSH 浓度降低，使其只够维持较小卵泡发育。而当这些较大的卵泡中有一个或几个发育为优势卵泡时，这个优势卵泡就开始分泌一些抑制因子，来抑制其它小卵泡的发育。在此阶段，卵泡的发育主要受到LH 的调控，且由于这些卵泡内的E2 浓度较高，在与FSH 共同作用下可使得颗粒细胞上的FSH

受体和LH受体增加，从而来维持这些优势卵泡的发育。但LH 的脉冲模式决定了这些优势卵泡最后能否成熟排卵，当LH 的脉冲模式较强时，就使颗粒细胞产生大量的E2 来促使这些大的优势卵泡成熟排卵。若LH 脉冲模式较弱时，颗粒细胞就不能产生足量的E2，也不能使排卵前LH 出现高峰。在下一个发情周期到来之前优势卵泡加速生长，利用了几乎所有的促性腺激素，致使那些小卵泡发生闭锁退化。

家畜在发情期间促黄体素排放频率加快，可使优势卵泡逐渐增加雌二醇的分泌。当优势卵泡成熟时，它所分泌的雌二醇产生正反馈作用导致垂体大量释放促黄体素。促黄体素可使卵母细胞恢复减数分裂，成熟卵泡分泌前列腺素类似物，进而促进卵泡膜细胞释放胶原酶而溶解局部组织出现排卵过程。因此认为，超排的过程就是应用超过体内正常水平的外源性促卵泡激素，使将要转化为闭锁卵泡的有腔卵泡发育成熟而排卵由于在动物的发情周期中常出现2 个或3 个卵泡波，选择恰当的时机通过激素处理对动物进行超排处理，可促使卵巢上更多的卵泡发育。垂体分泌和释放的FSH 和LH 对卵泡的发育和排卵具有重要的调控作用。FSH 不仅可以刺激卵泡的生长，还可刺激颗粒细胞增加FSH 受体数和受体结合力，而且还可刺激颗粒细胞分泌雌激素，并在启动卵泡腔的形成过程中起着重要的作用。而LH正常分泌时也可促进卵泡的发育。因此，卵泡在选择阶段、优势化阶段受到FSH和LH的调控。在发情期，LH释放加快，当LH释放达到高峰时发生排卵。试验证明，动物有腔卵泡闭锁之前，注射FSH 或PMSG，能使大量的卵泡不发生闭锁而正常发育成熟，在排卵之前注射LH来补充内源性LH的不足，可以使多数发育成熟的卵泡同时排卵。

2.羔羊超数排卵的常用方法

超排处理就是降低发育卵泡的闭锁率，增加早期卵泡发育到高级阶段的数量，是一个连续的动态过程，这一过程受中枢神经系统、垂体前叶和卵巢问激素调控。超排处理常见的方法有：1）降低或消除卵巢对促性腺激素释放的负反馈反应，这主要针对FSH，如进行抑制素免疫；2）增加外源激素，提高血液中促性腺激素浓度。生产中较多采用后者，而且常与刺激内源促性腺激素释放的方法结合进行。

羔羊超排方法主要是利用外源促性腺激素(孕激素、促卵泡素和孕马血清等) 刺激卵泡发育,进而获取性成熟前羔羊卵母细胞。目前,羔羊超排方法主要有孕酮+ 促性腺激素和促性腺激素处理两种方法。

1）孕酮+ 促性腺激素方法 这种方法是将孕酮以栓剂形式放置阴道内一定时间后再用促性腺激素刺激,然后撤掉孕酮栓,再进行卵母细胞采集。Ledda 等对30～40 d 的羔羊进行激素处理:给羔羊埋栓(栓体积为成年羊的六分之一) 6 d ,撤栓前36 h 一次性分别注射120 IU GnRH 和400 IUPMSG。撤栓24 h 后采卵,每只羔羊平均得到(86.2 ±7. 9) 枚卵母细胞,成熟率为77. 9 %。Ptak 等给1 月龄的羔羊放置孕酮栓8 d ,第5 、6 、7 天每天早晚2 次注射2. 7 mg FSH ,第8 天撤栓采卵,得到约29枚卵母细胞,49. 8 %培养到成熟,囊胚率为22. 9 %。Morton 等通过性别分离的精子与羔羊卵母细胞受精并结合胚胎冷冻方法研究体外胚胎生产时,对羔羊超数排卵采用如下方法:先给3～4 周和6～7 周供体羔羊注射50μg 安息香酸雌二醇,48

h后将二分之一的含有3. 0 mg 的182甲炔诺酮栓埋植10 d ,在埋植第7 天时肌肉注射400 IU PMSG和1 支50

mg 猪促性腺激素(p2FSH) ,2 d 后再肌肉注射1 支40 mg p2FSH ,结果得到2 只羔羊。

2）促性腺激素处理 张锁链等(1994) 以FSH或FSH2L H 4 种不同处理方法对29 只68～110 日龄羔山羊进行处理,结果表明采用FSH2L H (肌注)进行处理得到的卵子经体外受精后,其卵裂率明显高于其它方法得到卵子的卵裂率。刘东军等对2～4 月龄的杂种羊,用FSH、FSH + L H(静脉注射) 、FSH + L H(肌注) 3 种方法进行激素处理,结果表明,FSH + L H (肌注) 组效果最好,平均回收到15. 0 枚卵母细胞,体外培养成熟率达76. 5 %。Kelly 等比较了FSH(4 ×40 mg) 分4 次等量(间隔12h) 和1 次(1 ×160 mg) 肌肉注射方法,最后一次注FSH 同时注射eCG 400 IU 。结果表明,FSH 分4 次等量注射效果最好,平均每只供体羔羊得到(88±22. 3) 枚卵母细胞,卵裂率为77. 5 %。Kelly 等对9 周龄的美利奴羔羊采用了类似的超排方法,结果最好的处理组平均每只羔羊得到(162. 3 ±23. 2) 枚卵母细胞,各处理组卵裂率为78. 2 %～93. 7 %。

目前，常采用多种激素方案对幼龄母畜进行处理， Armstrong 采用GnRH、FSH+LH、hCG 三种方法对犊牛和羔羊进行处理，均获得了可用的卵丘细胞-卵母细胞复合体，但FSH+LH 的方法获得的卵丘细胞-卵母细胞复合体数量和囊胚率较另外两种方法高。后来Grazyna Ptak 又采用FSH、FSH+eCG、FSH+eCG+GnRH 对1 月龄左右的羔羊进行处理，结果FSH+eCG 的方法获得的卵丘细胞－卵母细胞复合体的数量最高，然而单独注射FSH 的方法获得的囊胚率却最高。旭日干等对2～3 月龄的羔山羊进行FSH、FSH+LH、eCG 三种不同的方法处理，结果与Armstrong的结论一致，也表明FSH+LH 的方法获得的卵丘细胞-卵母细胞复合体的数量最多，但囊胚率都很低。Kelly等认为对1 月龄左右的羔羊进行激素诱导时采用FSH+ eCG 方法处理最佳，不仅可

获得较多的卵母细胞，而且还可生产出优质的胚胎，囊胚率达到60％，胚胎移植后平均每只羔羊可获得9.0-13.9 个后代。J D. Godkin等采用FSH+Va的方法对羊进行激素处理，结果全反式Va能够提高囊胚率，达到72％，胚胎妊娠率达70％。

3． 羔羊超数排卵的影响因素

羔羊的个体状况、年龄对卵泡数量和胚胎生产具有较大的影响。在自然状态下，胎儿卵巢上的有腔卵泡开始出现大约在怀孕晚期。母羊大约在妊娠期的135 天。出生之后有腔卵泡数量随着日龄的增加而增加，于羔羊出生后4～8 周龄达到高峰；以后随着青春期的到来开始减少。旭日干等对羔山羊卵泡发育及卵母细胞体外成熟研究时，发现40－60 日龄的羔羊卵泡数、卵母细胞数都较121－150 日龄多，且前者卵母细胞回收卵率（66％）明显较后者回收卵率（40.8%）高。后有研究者又从羔羊日龄不同卵巢重量存在差异方面进行分析。Grazyna Ptak 报道羔羊从出生到4周龄时卵巢的重量增加了7倍，随后开始下降，到羔羊33周龄时保持相对的稳定，大量的生长卵泡在羔羊出生后2周就可看到，到4-5周龄时卵母细胞数达到高峰，同时伴随着第一次卵泡的闭锁，以后卵泡的数目会逐渐的减少，这就说明羔羊卵巢上卵母细胞数最多的时期是在出生后的几周内。后来Grazyna Ptak 又分别对1，2，3，5，7 月龄的羔羊采用不同的激素处理，结果表明一月龄时卵母细胞数目较高，二月龄次之，三月龄较低，随后四月龄五月龄有所升高，表明羔羊卵巢上卵母细胞数与年龄有着密切的关系。因此为了充分利用羔羊可提供的大量的卵母细胞，在一些研究中常选用4－5周龄左右的羔羊作为试验对象。

生产大量体外胚胎的关键在于能够获得数目较多质量较优的卵泡细胞。而卵泡的发育不仅受外源激素处理类型的影响，而且还因内源性的激素分泌水平不同出现差异，N.C.Rawlings 和A.Jorio 的研究表明，犊牛或羔羊卵泡数量和大小在一定程度上与FSH 的分泌水平有关， FSH 分泌水平高的羔羊卵巢上生长发育的卵泡数较多，且选育后表现出的繁育性能也较好。当羔羊在注射少量的雌激素后，体内的FSH、LH 的分泌水平将上升，这时卵巢上卵泡的数量也明显增加，从而说明激素水平对卵巢反应性起着至关重要的作用；尤其是体内的FSH、LH 分泌水平对卵泡的发育有较大影响。处于不同发育阶段的羔羊，体内激素分泌水平也有着明显的区别，但目前研究结果都证实较高的FSH 水平可促使卵巢上更多的卵泡发育。

4. 重复超数排卵

超数排卵是在母畜发情的适当时期，用外源激素诱导雌性动物，使动物体内的激素达到阈值，从而诱发动物卵巢的大量的将要转化为闭锁卵泡的有腔卵泡发育成熟并排出具有受精能力的卵子的过程。而重复超排就是对同一母畜以一定的时间为间隔进行多次超排，以提高每只供体所获卵母细胞总数，从而提高供体遗传资源的利用效率的方法。在家畜的自然繁殖中，低排卵率、低妊娠率已经成为了制约优良母畜快速繁殖后代，产生经济效益的瓶颈问题。在这种情况下，利用激素诱导母畜进行超数排卵和重复超排成为了提高优良母畜的繁殖力、加速品种改良迅速扩大良种畜群的有效手段。超数排卵和重复超排大大提高了由

母畜获得的卵母细胞数目，为体外胚胎的研究培养和生产提供了大量的材料，使得动物繁殖的大量研究试验成为可能，是当今动物生殖研究领域中获取大量卵子或胚胎的基本方法之一。因此，对于研究、改善家畜超数排卵及重复超排技术，并使之成熟化、稳定化是动物生殖领域的科学研究和畜牧业生产中的一项重要研究课题。

在羔羊的超数排卵和重复超排研究中发现，供体羔羊每次超排处理所获卵母细胞数量会随重复超排次数的增加而逐渐减少。Valasi 等的研究表明对供体羔羊进行重复超排后，所获得的卵母细胞数目与初次超排相比较明显下降，并且，他们认为造成这一结果的主要原因是供体羔羊的卵巢对激素的反应性降低。陈晓勇等对幼龄羔羊进行超排研究，并间隔3周重复超排，结果显示供体羔羊重复超排获得的卵母细胞数目较初次超排明显降低，且差异极显著（ P<0.01）。相较于一次超排来说，重复超排次数增多、间隔变短、外源激素对卵巢的诱导效应减弱，卵巢上发育的卵泡数目和获得的卵母细胞数目减少。对于这些现象，目前的研究认为是由于经过多次激素诱导之后，机体对外源性促性腺激素发生了免疫反应，从而产生激素抗体，使得供体对外源激素的敏感性和反应性降低。除此之外，在重复超排过程中，通过手术法采集卵子或胚胎会因为手术损伤、出血等造成卵巢、输卵管及子宫等相互粘连，在一定程度上也会影响卵母细胞采集效果。可见，改进手术采卵方法、降低手术粘连和对卵巢的损伤程度也有利于提高供体羔羊的重复超排效率。

4 羔羊超数排卵存在的问题

目前，世界上利用幼畜作供体进行超数排卵生产体外卵母细胞的效果还不是很稳定，体外受精胚胎的移植受胎率较低是一个普遍问题，因此需要深入开展影响幼畜超数排卵技术效率因素的究。与成年羊相比，羔羊卵母细胞的体外发育能力，胚胎妊娠率都较低。D.T.Armstrong 在用羔羊进行体外胚胎时囊胚率达到33％与成年羊38％相比略低，且羔羊胚胎移植后生存率为30－45％也稍低于成年羊。同样Grazyna Ptak 实验中观察到羔羊卵母细胞发育的囊胚和成年羊囊胚虽然在形态上没有明显的区别，都有可见的内细胞团，但是羔羊胚胎发育明显较成年羊晚，成年羊囊胚一般在卵母细胞发育培养6 天后形成，而羔羊囊胚则在第8

或9 天出现，这种现象很可能是羔羊发育还不健全，内分泌状况与成年羊存在差异所致，但深刻的机理有待研究。羔羊体外生产的胚胎妊娠率在移植到受体30－35 天后，胚胎的生存率只有40％。同时体外生产的胚胎在移植后胎儿的畸形率和初生重都较体内胚胎的高。畸形率的发生很可能是胚胎早期卵率阶段不适当的发育环境造成的，因此体外发育的条件还需提高完善。

由于幼畜体外胚胎生产大多是利用成年动物体外胚胎生产体系，导致幼畜体外胚胎生产效率普遍低，因此，需要进一步开展供体的选择、激素诱导的方法、卵母细胞采集的方式及体外发育培养的条件等的研究，不断完善幼畜超排方法、程序，以提高体外胚胎生产效率及探索适宜的超排方法来稳定超排效果。尽管如此，幼畜卵泡库对于育种和科研等方面的意义和潜力绝对是不容忽视的。若配合转基因和动物克隆技