山楂核中熊果酸含量的HPLC测定杨晓彤 程乐乐 糜 可 周韵丽 杨庆尧 上海师范大学微生物与免疫学研究所 (上海 200024)摘要:采用C18反相高效液相色谱RP-HPLC法对山楂核中的熊果酸作含量测定。结果:测得山楂核中的熊果酸含量为01577mg/g,回收率为103113%,保留时间和峰面积的变异系数分别为0118%和1168%(n=8)。山楂核甲醇萃取液在作HPLC分析前,先用硅胶柱吸附,再用洗脱液(环己烷:乙酸乙酯:冰醋酸=12B4B1)洗脱,可去除大部分杂质,提高测定效果。关键词:山楂核(SeedofCrataeguspinnatifida),熊果酸,RP-HPLC中图分类号:R282.6 文献标识码:B文章编号:1008-861X(2001)01-0055-03

基金项目:上海市高等学校科学技术发展基金资助项目(96011) 熊果酸(Ursolicacid,UA)属三萜类化合物,广泛存在于山楂、乌梅、夏枯草等植物[1]。近年发现熊果酸除有抗炎、抗突变活性外,对多种恶性肿瘤细胞亦有强烈的毒杀效应[2~4],并有诱导癌细胞分化的能力[5]。已知山楂中含熊果酸[6]。有人在山楂核中也检测到熊果酸[7],但迄今未见其含量报道。本文用HPLC测定了山楂核中的熊果酸含量。1 仪器与材料 仪器:BeckmanGoldSystem高效液相色谱仪及软件,125型泵,168型紫外二极管阵列检测器;BeckmanUltrasphereC18反相柱(416@250mm,加416@50mm保护柱);旋转蒸发器为B󰀁chi公司产品;CQ250超声波发生器产自上海超声仪器厂。 材料:熊果酸标准品由中国药品生物制品检定所提供。山楂购自天津市场,品种名:大红袍。测定用甲醇为色谱级。提取用试剂(甲醇、环己烷、乙酸乙酯、冰醋酸)均为化学纯。层析硅胶为上海五四化学试剂厂产品。2 方法与结果2.1 山楂核样品制备、预处理及熊果酸检出2.1.1 样品提取: 将鲜山楂沸水煮1min后,分离山楂核,60~80e烘干,打成200目的细粉,精密称取山楂核粉1g,加100ml甲醇,90e水浴回流提取6h或置超声波发生器内超声提取1h,过滤,取滤液减压蒸干,残渣用甲醇溶解并定容至5ml,待作硅胶柱预处理。2.1.2 硅胶柱预处理: 取100g层析用硅胶,用二倍柱体积的洗脱液(环己烷:乙酸乙酯:冰醋酸=12B4B1,V/V)洗脱,100e烘至无酸味。取118g装成id8@85mm的硅胶柱。精密吸取015ml待处理样品于硅胶柱上,待甲醇挥干后用7ml层析液(环己烷:乙酸乙酯:冰醋酸=12B4B1)洗脱,收集洗脱液,减压蒸干,用甲醇溶解并定容至1ml,0122mm膜过滤后进行HPLC分析。2.1.3 样品测定结果 山楂核提取样品经硅胶柱预处理后上HPLC仪测定,测定用流动相为甲醇/水(用甲酸调pH至3)=95/5(V/V);流速:1ml/min;进样量:20Ll;在215nm波长下检测,用熊果酸标准品作对照。结果:样品在熊果酸标准品的出峰位置上出现相同的色谱峰(图1)。另在样品中加入熊果酸标准品后该峰的面积增加,但保留时间未改变,且没有出现新增的峰(图2)。

a:山楂核甲醇提取物 b:熊果酸Methanolextractofthe Ursolicacid(uA)SeedsofC.pinnatifida图1 山楂核甲醇提取物与熊果酸标准品HPLC色谱图Fig.1 HPLCchromatogramsofmethanolextractoftheseedsofC.pinnatifida 除上述色谱图外,另以每秒4次的频率记录190~320nm范围内的光谱吸收,结果两者的光谱吸收图完全一致,其最大吸收在204nm(图3a)。将上述光谱进一步作二阶导数变换,其二阶导数光谱也完全一致(图3b)。由此可见两者为同一物质,

山楂核提取物中的该色谱峰为熊果酸吸收峰。第15卷第1期2001年3月上海中医药大学学报 ACTAUNIVERSITATISTRADITIONISMEDICALISSINENSISPHARMACOLOGIAEQUESHANGHAIVOL.15NO.1Mar.,2001

a:未加熊果酸标准品 b:已加熊果酸标准品NotUAadded UAisadded图2 样品中加入熊果酸标准品前后的HPLC色谱图Fig.2ChromatogramsofHPLCbeforeandafterUAisaddedtothesample

a:紫外吸收光谱 b:紫外吸收光谱的二阶导数光谱UVspectrogram SecondderivativespectrogramofUV图3 山楂籽中熊果酸与标准品的紫外吸收光谱及其二阶导数光谱Fig.3 SpectrogramsofUVandsecondderivativeofUAandseedsofC.pinnatifida2.1.4 样品预处理效果 比较样品经硅胶柱预处理前后的HPLC图,结果见图4。

a:未经预处理 b:经预处理Beforepre-treatment Afterpre-treatment图4 样品经硅胶柱预处理前后HPLC色谱图Fig.4 HPLCchromatogramsofthesilicagelcolumnbeforeandafterthepre-treatmentofsamples2.2 山楂核中熊果酸含量的HPLC测定2.2.1 标准曲线制作 精密称取干燥至恒重的熊果酸标准品9171mg,甲醇溶解成浓度为01971mg/ml的标准溶液。精密吸取该溶液,加甲醇配制成浓度分别为01194,01097,01049,01024,01012(mg/ml)的溶液进行HPLC测定,并计算回归方程。结果熊果酸峰面积(P.A.)与熊果酸浓度(Conc.)关系为:P.A.=12411465Conc.)01305649(r=019998)。2.2.2 精密度测定 取熊果酸标准溶液(浓度为011942mg/ml)连续进样8次,结果见表1。表1 精密度测定结果Tab.1 ResultofprecisiondeterminationInjectiontimeRT(min)Peakarea1912850211882529124902210421391258021160514912390211120359127002117753691258022140427912800211709289124702118517󰀂x?s912608?0101632117988?013668CV(%)01176116802.2.3 提取方法比较及山楂核中熊果酸含量的测定:分别用甲醇回流和甲醇超声提取三份山楂核样品,经硅胶柱预处理后进行HPLC分析,分析条件同2.1.3。结果见表2。表2 两种提取方法所得山楂核中熊果酸量的比较(mg/g)Tab.2 ComparisonofcontentsofUAofseedsofC.pinnatifidabytwoextractionmethodsSampleRefluxextractUltrasonicextract101577015042016020156930155101597󰀂x?s01577?0100301557?01005*CV(%)41418150ComparedwithRefluxextract*P>01052.2.4 回收率测定:精密称取3份山楂核粉,每份1g,每个样品均平行测定2次,然后再在样品中各加入熊果酸标准品011942mg,结果见表3。54实验研究表3 回 收 率Tab.3 RecoveryrateSampleContentsofUAinsampleUAaddedDetectcontentRecoveryrateAverageCV(%)10157701194017791011012016020119401825103166103113118530155101194017801041713 讨论3.1 熊果酸甲醇溶液经紫外吸收光谱扫描,其最大吸收波长为204nm,但甲醇在此波长下亦有很强的背景吸收,为减少干扰,我们按郝氏的建议[8],选择215nm作为熊果酸的检测波长。测得的熊果酸最大吸收波长为204nm,与赵氏[9]报道基本一致,但与郝氏[8]报道有较大差异。其原因可能是彼此选用的液动相极性和pH差异的缘故。对两种提取方法的比较,超声提取1h的熊果酸提取量与回流提取6h的提取量相当,提取速度超声法远比回流法快,但超声提取的变异系数高于回流提取法(表2)。所测得山楂核中的熊果酸平均含量为01577mg/g,低于文献报道的山楂果肉中的熊果酸含量[8],但高于国外从高山植物蔓九节(Psychotriaserpens)中提取的熊果酸量[10]。山楂核系废弃物,从山楂核中提取熊果酸,为山楂核利用提供了新途径。3.2 样品中的杂质在作HPLC分析时,会对结果产生严重干扰,甚至会导致分析柱失效。有人提出先用石油醚浸泡的方法作预处理以减少杂质[9],但残渣经石油醚浸泡后容易松动脱落,造成熊果酸的损失。我们用硅胶柱作预处理,既不丢失熊果酸,杂质含量又大大减少,保证了测定的准确性。3.3 对山楂核提取物作测定时发现,在熊果酸峰前另有一小峰,经与齐墩果酸标准品在相同条件下对比,两相重叠。推测山楂核中另存在着少量的齐墩果酸,这与山楂的分析结果相似,山楂中除含熊果酸外,亦含少量齐墩果酸[7][9]。参考文献:[1]黄镜,孙燕:熊果酸的抗肿瘤活性[J]。中国新药杂志,1997,6(2):101.[2]EssaadyD,SimonA,OllierM,etal:InhibitoryeffectofursolicacidonB16proliferationthroughcellcyclearrest[J].Cancer-Lett,1996,106(2):193.[3]ChoiBM,ParkR,PaeHO,etal:Cyclicadenosinemonophosphatein-hibitsursolicacid-inducedapoptosisviaactivationofproteinkinaseAinhumanleukaemicHL-60cells[J].PharmacolToxxicol,2000,86(2):53.[4]HsuHY,YangJJ,LinCC:Effectofoleanolicacidandursolicacidoninhibitingtumorgrowthandenhancingtherecoveryofhematopoieticsys-tempostirradiationInmice[J].CancerLett,1997,111(1-2):7.[5]LeeHY,ChungHY,KimKH,etal:InductionofdifferentiationintheculturedFqteratocarcinomastemsellsbytriterpeneacids[J].CancerResearchClinicalOneology,1994,120(9):513.[6]张立群、何文:薄层荧光色谱内标法测定湖北山楂中熊果酸的含量[J].药物分析杂志,1995,15(1):30.[7]孙晓文、姚乾元:山楂核的化学成分[J].中草药,1987,18(10):9,22.[8]郝润喜、阎彩萍、孙晓飞,等:山楂中熊果酸高效液相色谱分析[J].药物分析杂志,1994,14(2):30.[9]赵世萍、陈玉武、付桂香:高效液相色谱法测定夏枯草中熊果酸的含量[J].中日友好医院学报,1996,10(3):201.[10]LeeKH,LinYM,WuTS,etal:TheCytotoxicprinciplesofprunellavulgaris,PsychotriaserpensandHyptiscapitata:Ursolicacidandrelat-edderivatives[J].Plantamedica1988,308.编辑:黄 健修回日期:2000-12-19DeterminationofUrsolicAcidContentinSeedsofCrataegusPinnatifidabyHPLCYANGXiao-tong,CHENGLe-le,MIKe,ZHOUYun-li,YANGQing-yaoInstituteofMicrobiologyandImmunology,ShanghaiTeachersUniversityABSTRACT:ThecontentofursolicacidintheseedsofCrataeguspinnatifidawasdeterminedbyC18reversephasehighperformanceliquidchromatography.Bymethanol:water(95B5)asamobilephaseandunder215mmwavelength,thecontentofursolicaciddeter-minedineachgramoftheseedsofCrataeguspinnatifidawas01577mgandtherecoveryratewas103113%.Thevariantcoeff-icientoftheretentiontimeandpeakareawasrespectively0118%and1168%(n=8)inagoodprecision.BeforeHPLCanalysis,methanolseedextractswerepurifiedonsilicagelcolumnsandthenelutedwithanelutingfluid(cyclohexaneBethylacetateBaceticacid=12B4B1)toremovemostimpuritiesandenhancethedeterminingef-fect.KEYWORDS:SeedsofCrataeguspinnatifida,ursolicacid,re-versephaseHPLC55实验研究