网络出版时间：2012-04-28 15:36网络出版地址：/kcms/detail/61.1399.R.20120428.1536.001.html携带NT4-AcSDKP融合基因重组腺相关病毒载体的构建何娟娟1，马列婷2，王亚文2，惠凌云2，杨广笑3，王全颖3（1.西安交通大学医学院临床检验诊断专业，陕西西安710061；2.西安交通大学第一医院检验科，陕西西安710061；3.西安华广生物工程有限公司，陕西西安710025）摘要：目的构建携带NT4-AcSDKP融合基因的重组腺相关病毒，为探讨AcSDKP（乙酰化-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸）的多样化功能提供基础。
方法以质粒载体pGEM-T Easy/NT4为模板，PCR技术获得NT4-AcSDKP基因片段，插入腺相关病毒载体穿梭质粒PSSHG-CMV，构建重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP。
用腺病毒全基因组质粒pFG140、辅助质粒pAAV/Ad和已构建的重组质粒，三质粒磷酸钙共沉淀法转染80%融合的293细胞，包装rAAV-NT4-AcSDKP，RT-PCR方法测定重组腺相关病毒滴度。
结果成功合成NT4-AcSDKP基因，构建重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP，包装获得滴度为3.40×1010copies/ml的重组腺相关病毒。
结论成功获得表达AcSDKP重组腺相关病毒，为抗炎、抗纤维化、器官修复等方面的进一步研究奠定了基础。
关键词：NT4-AcSDKP；PCR技术；重组腺相关病毒中图分类号：文献标志码：A 文章编号：1671-8259Construction of NT4-AcSDKP recombinant adeno-associated virusHE Juan-juan1, MA Lie-ting2, WANG Ya-wen2, HUI Ling-yun2,YANG Guang-xiao3, WANG Quan-ying3(1. Specialty of Clinical Diagnosis, Medical School of Xi’an Jiaotong University,Xi’an, 710061; 2. Department of Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital,Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061; 3. Xi’AN HuaguangBiological Engineering Co. Ltd., Xi’ an, 710025, China)ABSTRACT: Objective To construct and produce the NT4-AcSDKP recombinantadeno-associated virus (AAV) and determinate the titer. Methods With plasmid收稿日期：2011-12-15 修回日期：2012-03-10通讯作者：马列婷，主任技师. E-mail: mltmed@作者简介：何娟娟（1985-），女（汉族），硕士研究生. E-mail: he88531250@vector pGEM-T Easy/NT4 as the template, NT4-AcSDK was obtained by polymerase chain reaction (PCR) and inserted into vector plasmid PSSHG-CMV to construct the recombinant plasmid pSSCMV-NT4-AcSDKP. The recombinant AAV-NT4-AcSDKP was packaged through co-transfecting 80% of confluent 293 cells with adenovirus full genome plasmid pFG140, helper plasmid pAAV/Ad and the recombinant plasmid. The recombinant AAV-NT4-AcSDKP was titrated by RT-PCR. Results The gene of NT4-AcSDKP was synthesized and the recombinant plasmid pSSCMV-NT4-AcSDKP was constructed successfully. RT-PCR results showed that we had obtained the rAAV of high titer (3.40×1010copies/ml). Conclusion We have successfully obtained the AcSDKP-expressing rAAV and paved the way for further studies on anti-inflammation, anti- fibrosis, and organ repair.KEY WORDS: NT4-AcSDKP; polymerase chain reaction (PCR) technique; recombinant adeno-associated virus (rAAV)近年来，由于AcSDKP（乙酰化-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸）在人体内广泛存在且生物功能多样化引起科学工作者的广泛关注，经大量研究证实四肽AcSDKP可以抑制造血干/祖细胞增殖，对人骨髓间充质干细胞也有抑制作用，在放化疗期间起到保护剂的作用[1]；促进血管发生、抗炎症、促进生殖系统发育等，而且对肾脏[2]、心脏[2-3]、肝脏[4]、肺[5]等器官损伤引起的纤维化也具有抑制作用，因此其成为研究热点，对多种临床疾病治疗具有巨大潜力。
然而AcSDKP 获得途径受限，目前几乎都是商品化合成，价格昂贵，因此本文应用PCR技术、T-载体克隆法和病毒包装技术，构建并包装表达目的蛋白AcSDKP的重组腺相关病毒，为深入开展AcSDKP在治疗炎症、器官纤维化等疾病方面的研究奠定了基础。
1 材料与方法1.1 材料质粒载体pGEM-T Easy/NT4，由张华博士构建赠送；克隆载体pGEM-T质粒购自Promega公司；限制性内切酶Eco RⅠ、Bam HⅠ、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶等试剂购自华美生物工程公司；辅助质粒pAAV/Ad、腺病毒全基因组质粒pFG140、腺相关病毒穿梭质粒pSSHG-CMV、293细胞系、大肠杆菌TOP10、E. coli DH5α菌株及试验设备等均由西安华广生物工程公司提供。
1.2 目的基因NT4-AcSDKP的PCR扩增根据Genbank提供的MSDKP基因序列和已有的pGEM-T Easy/NT4载体模板，使用负链延伸原理，设计正、反向引物，正向引物加入保护碱基和Eco RⅠ酶切位点（G↓AA TTC），反向引物加入保护碱基、终止子和Bam HⅠ酶切位点（G↓GA TCC），并使负向引物中3′端有20个碱基与模板互补，应用DNASIS计算机软件设计下列引物，引物为BioAsia94℃变性5min72℃再延伸的基因TOP10含Amp酶Eco1.3 质粒合酶切10g/L基因片段，连接产物转化感受态细菌E.coli DH5α，碱裂解法小提质粒用Eco RⅠ和Bam HⅠ联合酶切，筛选出重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP，然后碱裂解法大量提取重组阳性质粒（图1）。
重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP构建过程示意图1.4 、1.5 液中，1.6量60s，54℃2 结果2.1 cDNA克隆及鉴定以pGEM-T Easy/NT4载体为模板进行PCR，所得产物和DNA marker参照物相对比，琼脂糖凝胶电泳获得约270bp的NT4-AcSDKP 基因片段，该值与理论值相符(图2)。
构建的克隆载体质粒命名为pGEM-T /NT4-AcSDKP，大小约为3270bp。
经Eco RⅠ和Bam HⅠ酶切后，琼脂糖凝胶电泳结果可见约270bp的目的片段，与理论值相符，显示阳性重组质粒被完全切开，说明NT4-AcSDKP成功重组于pGEM-T内(图3)，并且在测序的回报结果中找到NT4-AcSDKP融合基因序列，应用DNASIS软件分析，显示测序结果与我们设计的融合基因序列完全一致。
a b270bp图2 产物电泳图Fig.2 Identification of PCR product of NT4-AcSDKP cDNAa：PCRa b c图3 pGEM-T /NT4-AcSDKP酶切电泳鉴定Fig.3 Restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmidac：2.2 ，转化感受态细菌E.coli DH5α菌株，提重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP，Eco R I和Bam HⅠ联合酶切后，10g/L琼脂糖凝胶电泳，分别得到约为270bp与5202bp两基因片段，与理论值相符(图4)。
a b c图4 pSSCMV-NT4-AcSDKP酶切鉴定电泳图谱Fig.4 Restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmid pSSCMV-NT4-AcSDKPa：重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP；b：重组质粒经E co RⅠ、B am HⅠ酶切；c：DNA Marker。
2.3 重组腺相关病毒的包装与滴度测定结果将成功构建的pSSCMV-NT4-AcSDKP、包装质粒pAAV/Ad和腺病毒全基因组质粒pFG140，采用三质粒磷酸钙共沉淀法转染80%融合的293细胞，包装得到重组腺相关病毒。
利用RT-PCR法测定滴度为3.40×1010 copies/ml。
3 讨论AcSDKP是胸腺素β4（Tβ4）的氨基端四肽，其氨基端含有POP（脯氨酰寡肽酶）裂解位点，经此酶裂解可获得四肽AcSDKP。
根据等电点的不同，胸腺素分为a、β、γ三类。
β族胸腺素等电点为5.0～7.0，其结构高度保守，由40～44个氨基酸组成，目前已发现的β族胸腺素有15种，其中Tβ4是在人体内分布最广泛、含量最多的，具有多种功能，如抗炎症[6]、修复损伤组织[7]等。
作为Tβ4的氨基端肽，AcSDKP具有同样的生物功能，如通过抑制造血干/祖细胞、骨髓间充质干细胞的增殖，在癌症病人治疗期间发挥保护骨髓造血功能的作用；促进血管发生、抗炎等，另外其对各种损伤因素引起肾脏[2]、心脏[2-3]、肝脏[4]的纤维化也具有抑制作用。