银杏叶提取物对活化血小板刺激人冠状动脉内皮细胞产生ROS 以及表达LOX-1和磷酸化p38MAPK 的影响朱贤关李忠东1王建昌2孟如松3（安徽医科大学研究生学院，安徽合肥230000）〔摘要〕目的研究银杏叶提取物（Ginkgo biloba extract ，EGb ）对活化血小板刺激人冠状动脉内皮细胞（human coronary artery endothelial cells ，HCAECs ）产生ROS 和表达LOX-1、磷酸化p38MAPK 的影响。
方法将HCAECs 随机分为空白组，活化血小板组和活化血小板+银杏叶提取物低、中、高剂量组（分别为4、40、400μg /ml ），应用H 2DCF-DA 探针、Western 印迹分别检测ROS 的产生以及LOX-1和磷酸化p38MAPK 的表达。
结果活化血小板可以介导HCAECs 表达ROS 、LOX-1和磷酸化p38MAPK （P ＜0.05）；EGb 能明显抑制ROS 的产生以及LOX-1和磷酸化p38MAPK 的表达（P ＜0.05），随着EGb 浓度增高，ROS 和LOX-1抑制效果越明显，磷酸化p38MAPK 现象不明显。
结论EGb 对HCAECs 的保护机制可能与抑制ROS 、LOX-1和磷酸化p38MAPK 的表达有关。
〔关键词〕银杏叶提取物；活化血小板；ROS ；LOX-1；磷酸化p38MAPK 〔中图分类号〕R28〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-9202（2012）03-0546-03；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.03.047基金项目：首都医学发展科研基金（No.SF-2007-II-06）1空军总医院药学部2空军总医院空军老年医学研究所3空军总医院中心实验室皮肤科通讯作者：王建昌（1960-），男，教授，博士生导师，主要从事老年心血管病研究。
第一作者：朱贤关（1985-），男，在读硕士，主要从事老年心血管病研究。
动脉粥样硬化（atherosclerosis ，AS ）的发病机制有多种学说，如损伤反应学说、AS 氧化学说（oxidative hypothesis ）等，实验证明，他汀类、阿司匹林、维生素E 和C 等和某些中药通过抗氧化作用，阻断AS 的发展。
银杏叶提取物（EGb ）是天然中草药银杏叶的提取物，主要成分有黄酮类、萜类、原花色素类以及其他未知成分〔1〕。
研究证明，该药治疗心脑血管疾病作用机制主要是抑制体内自由基〔2〕和血小板活化因子（platelet activating factor ，PAF ）的产生〔3〕。
本文观察活化血小板与内皮细胞上的脂氧合酶同工酶（LOX-1）受体结合后对自由基产生的影响，并分析丝裂素活化蛋白激酶（p38MAPK ）磷酸化通路产生炎症因子的影响。
1材料与方法1.1材料1.1.1细胞人冠状动脉内皮细胞（human coronary endotheli-al cells ，HCAECs ）。
购自ScienCell TM 实验室（ScienCell TM Re-search Laboratories ）；血小板，健康成年志愿者，抽血前2w 内未吸烟，未服用任何抗血小板药物。
1.1.2药物、试剂及仪器EGb （中国药品生物制品检定所）；二氯二氢荧光素二乙酯（2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diace-tate ，H 2DCF-DA ）探针（Invitrogen 公司），小鼠抗人LOX-1单抗（R＆D systems 公司），小鼠抗人p-p38MAPK 单抗（Santa Cruz 公司），小鼠抗人β-肌动蛋白（β-actin ）抗体，辣根过氧化物酶（HRP ）标记山羊抗小鼠抗体（中杉金桥）。
离心机，荧光显微镜，温箱。
1.2方法1.2.1活化血小板制备健康成年志愿者，抽血前2w 内未吸烟，未服用任何抗血小板药物。
未扎止血带抽取新鲜静脉血20ml ，注入含有3.8%枸橼酸钠（1ʒ9）抗凝溶液的聚丙乙烯试管内，上下颠倒轻摇充分混匀；立即室温下1200r /min 离心5min ，收集富集血小板血浆（platelet-rich plasma ，PRP ）；PRP 室温下3000r /min 离心15min ，沉淀血小板用台式缓冲液洗涤2次，并复悬于台式缓冲液，调整血小板计数为2ˑ108/ml 〔1〕。
加入终浓度为5μmol /L 的ADP ，轻摇充分混匀20min ，即为活化血小板，备用。
1.2.2分组HCAECs 培养参照以前实验〔4〕，将第5 7代HCAECs 随机分为空白组、活化血小板组、活化血小板+EGb 低剂量组（4μg /ml ）、活化血小板+EGb 中剂量组（40μg /ml ）、活化血小板+EGb 高剂量组（400μg /ml ）。
活化血小板（2ˑ108/ml ）与内皮细胞在37ħ温箱孵育12h 后，加入药物EGb ，再孵育12h 。
1.2.3H 2DCF-DA 探针检测活性氧（ROS ）的表达加入药物再孵育12h 后，每组加入终浓度为2μmol /L 的H 2DCF-DA 探针，继续孵育30min ，快速在荧光显微镜下观察并采集图像。
用CMIAS 医学图像分析系统（北京航空航天大学研发）分析采集图像，以平均光密度（视觉平均颜色的深度）表示荧光强度。
1.2.4Western 印迹检测LOX-1和磷酸化p38MAPK 的表达取孵育完成的内皮细胞，除去培养基并用磷酸盐缓冲液（PBS ）洗涤3次，胰酶消化收集细胞，加复苏促进因子结合蛋白A （RIPA ）裂解液，在冰上裂解，提取蛋白质后二喹啉甲酸（BCA ）法进行蛋白浓度测定。
加上样缓冲液，100ħ变性10min ，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE ）电泳分离蛋白，再通过转膜将蛋白转到0.45μm 聚偏氟乙烯（PVDF ）膜上，用Tris 盐酸盐缓冲液（TBST ）配制的5%脱脂奶粉封闭1h ，分别加入一抗（LOX-1，1ʒ200；p-p38MAPK ，1ʒ300；β-actin ，1ʒ2000），4ħ过夜，TBST 洗膜，5min 3次，加HRP 标记二抗（1ʒ10000），室温孵育1h ，TBST 洗膜，5min 3次，加ECL 显影液，曝光。
Quantity One 软件分析处理扫描图像。
1.3统计学方法应用SPSS13.0统计软件，数据资料以x ʃs表示，采用单因素方差分析，多样本间均数比较采用完全随机方差分析SNK-q 检验。
2结果2.1活化血小板诱导ROS 、LOX-1和磷酸化p38MAPK （p-p38MAPK ）表达活化血小板与HCAECs 孵育之后，可显著诱导ROS 产生，显著诱导LOX-1和p-p38MAPK 表达（P ＜0.05）。
见图1。
2.2EGb 抑制ROS 产生低、中、高剂量组平均光密度分别为0.89ʃ0.27，0.53ʃ0.07，0.42ʃ0.16；空白组、活化血小板组平均光密度分别为0.29ʃ0.04、0.97ʃ0.24。
可见不同浓度的EGb 对ROS 的产生均有明显的抑制作用（P ＜0.05），且具有剂量依赖性。
图1。
图1荧光显微镜下各组ROS 表达水平2.3EGb 抑制LOX-1表达不同浓度的EGb 对LOX-1的表达均有明显的抑制作用（P ＜0.05），且具有剂量依赖性。
见表1，图2。
2.4EGb 抑制p-p38MAPK 表达EGb 对p-p38MAPK 有显著抑制作用（P ＜0.05），但EGb 不同浓度对p-p38MAPK 的表达抑制作用无显著性差异。
见表1，图2。
1：空白组；2：活化血小板组；3：活化血小板+EGb 低剂量组；4：活化血小板+EGb 中剂量组；5：活化血小板+EGb 高剂量组图2LOX-1和p-p38MAPK Western 印迹结果表1各组LOX-1和p-p38MAPK 表达比较（n =3）组别LOX-1/β-actin p-p38MAPK /β-actin 空白组0.132ʃ0.0190.600ʃ0.004活化血小板组0.344ʃ0.0481）0.851ʃ0.0141）活化血小板+EGb 低剂量组0.159ʃ0.0142）0.586ʃ0.0231）2）活化血小板+EGb 中剂量组0.094ʃ0.0222）3）0.580ʃ0.0271）2）活化血小板+EGb 高剂量组0.046ʃ0.0031）2）3）4）0.571ʃ0.0271）2）与空白组比较：1）P ＜0.05；与活化血小板组比较：2）P ＜0.05；与活化血小板+EGb 低剂量组比较：3）P ＜0.05；与活化血小板+EGb 中剂量组比较：4）P ＜0.053讨论目前证实，活化血小板主要与内皮细胞LOX-1结合，通过一定通路介导内皮细胞表达大量ROS〔3，4〕，导致内皮细胞功能障碍，进而导致AS 。
本实验证实，活化血小板与内皮细胞结合12h 后，再加入EGb 作用12h ，可使内皮细胞产生的ROS 明显下降，且具有剂量依赖性，提示EGb 可能阻断活化血小板与内皮细胞LOX-1结合后的信号转导通路。
内皮细胞上LOX-1有多种配体，如ox-LDL 、同型半胱氨酸、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和活化血小板等，这些配体与LOX-1结合后，可通过相同或不同的信号通道如p38MAPK 、p44/42-MAPK 、蛋白激酶C （PKC ）、蛋白激酶B （PKB ）、酪氨酸激酶（PTK ）等激活还原型辅酶Ⅱ（NADPH ）氧化酶〔5〕等氧化酶产生大量ROS 和核转录因子（NF-κB ）〔6〕表达，以及导致内皮细胞功能失调〔7〕。
何艳〔8〕等报道，银杏黄酮苷元对ox-LDL 诱导的人脐静脉内皮细胞LOX-1表达具有抑制作用；梁燕玲〔9〕等研究证实，银杏叶提取物对同型半胱氨酸诱导LOX-1mRNA 的表达具有抑制作用；徐西振〔10〕等发现EGb 抑制TNF-α诱导的牛主动脉内皮细胞LOX-1的表达。
本实验发现，活化血小板与内皮细胞结合12h 后，加入EGb 作用12h ，也可使内皮细胞上LOX-1表达量下降，且具有剂量依赖性，提示EGb 可以阻断不同配体与LOX-1结合后的信号通路。
在上述信号通道中，MAPK 介导的信号转导通路是生物信号引起核反应的重要通路，在细胞生长、增殖、分化及凋亡的调节中起到至关重要的作用。
MAPK 家族主要有细胞外信号调节激酶（EKR1/ERK2）、应激活化蛋白激酶（JNK /SAPK ）和p38MAPK ，其中p38MAPK 通路是参与内皮细胞炎症反应的细胞内的重要通路，在致炎因子与LOX-1结合后，p38MAPK 由非磷酸化转化为磷酸化状态，促进下游底物的磷酸化，启动核因子，促进炎性介质分泌，介导炎症反应，参与AS 形成〔11〕。