第２４卷第９期　２０１２年９月　化学研究与应用　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｖｏ１．２４，Ｎｏ．９　Ｓｅｐ．，２０１２　

文章编号：１００４—１６５６（２０１２）０９—１３９７－０５　

酶解法制备方格星虫多肽及其抗氧化作用研究　

朱银玲　，刘华忠ｈ，李思东　，廖　艳　，李江明。　

（１．广东海洋大学实验教学部，广东　湛江５２４０８８；２．广东海洋大学理学院，广东湛江５２４０８８；　

３．广东海洋大学食品科技学院，广东湛江５２４０８８）　

摘要：采用木瓜蛋白酶酶解制备方格星虫多肽，通过单因素实验研究了加酶量、酶解温度、酶解时间、酶解ｐＨ　值和料液比等因素对羟自由基清除率的影响。通过正交试验确定了木瓜蛋白酶对方格星虫最佳的酶解工艺　条件为：加酶量３００　Ｕ／ｇ，酶解温度５０％，酶解时间６０　ｍｉｎ，酶解液ｐＨ值７．０，料水比１：３。在此条件下酶解方　格星虫获得多肽的羟自由基清除率为９５．４２％，表明方格星虫酶解物具有较明显的抗氧化能力。由高效体积　

排阻色谱（ＨＰＳＥＣ）法测得方格星虫多肽的分子量为５８６８。　关键词：木瓜蛋白酶；方格星虫；多肽；抗氧化　中图分类号：Ｒ２８５．５　文献标识码：Ａ　

Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　ｆｒｏｍ　ｓｉｐｕｎｃｕｌｓ　ｎｕｄｕｓ　ｂｙ　

ｅｎｚｇｍｌｏｙｓｉｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ａｎｔｉ－ｏｘｉｄａｔｉｏｎ　

ＺＨＵ　Ｙｉｎ．Ｌｉｎｇ　，ＬＩＵ　Ｈｕａ．ｚｈｏｎｇ　，Ｕ　Ｓｉ—ｄｏｎｇ　，ＬＩＡＯ　Ｙａｎ　，Ｕ　Ｊｉａｎｇ－ｒｕｉｎｇ　

（１．Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｏｃｅａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｚｈａｎｊｉａｎｇ　５２４０８８，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｏｃｅａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｚｈ　ｉａｎｇ　５２４０８８，Ｃｈｉｎａ；　３．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｏｃｅａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈａｎｊｉａｎｇ　５２４０８８，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　ｆｒｏｍ　Ｓｉｐｕｎｃｕｌｓ　ｎｕｄｕｓ　ｗａｓ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｂｙ　ｐａｐａｉｎ　ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ａｍｏｕｎｔｓ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍｅ，ｔｅｍｐｅｒａ—　ｔｕｒｅ，ｔｉｍｅ，ｐＨ　ｖａｌｕｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ａｎｄ　ｗａｔｅｒ　ｏｎ　ｈｙｄｒｏｘｙ　ｒａｄｉｃａｌ　ｃｌｅａｎｉｎｇ　ｒａｔｉｏ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｂｙ　ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｔｅｓｔ．Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ　ｗｅｒｅ　ａｓ　ｆｏｌｌｏｗｓ：３００Ｕ／ｇ　ｏｆ　ａｍｏｕｎｔｓ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍｅ．５０℃ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，６０ｒａｉｎ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｔｉｍｅ　ａｎｄ　ｐＨ＝７．０，１：３　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｘｙ　ｒａｄｉｃａｌ　ｃｌｅａｎｉｎｇ　ｒａｔｉｏ　ｗａｓ　９５．４２％，ｗｈｉｃｈ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　ｆｒｏｍ　Ｓｉｐｕｎｃｕｌｓ　ｎｕｄｕｓ　ｈａｄ　ｅｖｉｄｅｎｔ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａｎｔｉ－ｏｘｉｄａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｏｆ　ｐｅｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　ｆｒｏｍ　Ｓｉｐｕｎｃｕｌｓ　ｎｕｄｕｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ＨＰＳＥＣ　ｗａｓ　５８６８．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐａｐａｉｎ；ｓｉｐｕｎｃｕｌｓ　ｎｕｄｕｓ；ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ；ａｎｔｉ－ｏｘｉｄａｔｉｏｎ　

方格星虫（Ｓｉｐｕｎｃｕｌｓ　ｎｕｄｕｓ），俗称沙虫，属星　

虫门星虫科，又称光裸星虫、沙肠子等，其体呈长　

筒形，很像一根肠子，体长约１Ｏ～２０厘米，且浑身　

光裸元毛，体壁纵肌成束，每环肌交错排列，形成　方块格子状花纹，所以又被称为裸体方格星虫。　

活性自由基对生物膜和其他组织可产生一系列的　危害，海洋生物抗氧化剂可通过各种途径清除内　

源性和外源性自由基，具有抗氧化作用强、种类　

多、结构复杂、副作用低等特点¨　。抗氧化活性肽　

是天然抗氧化剂研究热点之一，而且现在大部分　

抗氧化活性肽是通过蛋白酶在温和条件下水解蛋　白质而获得，食用安全性高［２］。林琳等人　发现　

收稿日期：２０１２－０４－２３；修回日期：２０１２－０６—１２　基金项目：国家自然基金项目（３１７１６６７）资助；广东海洋大学自然基金项目（１０１２１６３）资助　联系人简介：刘华忠（１９７４一），男，副教授，主要研究方向：海洋生物活性物质。Ｅ—ｍａｉｌ：９０２０３０＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ

　１３９８　化学研究与应用　第２４卷　

鱿鱼皮胶原蛋白水解肽在试验动物体内具有抗氧　

化作用。张桂和等人　研究发现方格星虫经木瓜　

蛋白酶酶解后酶解物含有蛋白质、多肽以及游离　

氨基酸等成分，并具有较强的抗氧化作用。本文　

采用湛江产方格星虫作为实验材料，利用木瓜蛋　

白酶解法制备抗氧化酶解物，并优化酶解工艺。　

旨在为更好的研究、开发和利用方格星虫提供理　

论依据。　

１材料与方法　

１．１实验材料　

优质新鲜方格星虫购于湛江东风水产品市　场，用蒸馏水洗净泥沙，去肠肚，用不锈钢剪刀剪　

碎，用绞碎机搅成糊状，置冰箱冷冻保存备用。　

１．２主要仪器及试剂　

１．２．１　酶及主要试剂木瓜蛋白酶购自广西庞　

博生物工程有限公司。干酪素、，Ｊ一酪氨酸、磷酸氢　

二钠、磷酸二氢钠、磷酸、氢氧化钠、硫酸亚铁、双　

氧水、甲基紫等均为分析纯，以上试剂均购自广州　

化学试剂厂。　

１．２．２主要仪器ＴＵ一１９０１双光束紫外可见分光　

光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、ＭＰ２００Ａ　

电子分析天平（上海精科天平）、０４０８￣型低速台式　

离心机（上海医疗器械有限公司）、ＨＨ－６恒温水浴　锅（江苏省金坛市环宇科学仪器厂）、７２００可见分　

光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）、ＨＩ２２１０酸　

度计（意大利哈纳）、ＬＣ－２０ＡＴ型液相色谱仪（美国　

Ｗａｔｅｒｓ高效液相色谱仪）、ＰＲＯＴＥＩＮ－ＰＡＫ　６０　

（ＷＡＴ０８５２５０）蛋白凝胶柱（广州市东征化玻仪器　

有限公司）。　

１．３实验方法　

１．３．１木瓜蛋白酶活力的测定　儿钊　采用Ｆｏｌｉｎ　

酚法测定酶活力。　

１．３．２酶解液的制备在温度５０＇Ｅ、ｐＨ７．０、酶　解时间１　ｈ、酶加入量３００Ｕ／ｇ、底物浓度１：３的条　

件下用木瓜蛋白酶对方格星虫进行水解，制备酶　

解液，用等体积的０．４　ｍｏ］／Ｌ的三氯乙酸沉淀未被　

酶解的蛋白质，然后经过０．４５　ｍ滤膜过滤，得到　

酶解液。　

１．３．３酶解工艺优化单因素实验：取５　ｇ方格　

星虫原浆，用木瓜蛋白酶进行酶解，以羟自由基清　

除率为指标，分别对方格星虫加酶量、酶解温度、　

酶解时间、酶解ｐＨ值、料液比五个因素分别进行　测定，确定单因素优化条件。方格星虫的酶解工　

艺因素水平见表１。　表１　方格星虫的酶解工艺因素水平　Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｈｅ　Ｓｉｐｕｎｃｕｌｓ　ｎｕｄｕｓ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｌｅｖｅｌ　

垩　Ⅱ醒量　ｇ温度　时间　尘　液比　１　１００　５０　４Ｏ　１：２　２　

３　３００　

４ｏｏ　５５　

６０　６０　

８０　１：３　

１：４　

１．３．４方格星虫的酶解方法在温度５ｏ℃、ｐＨ７．０、　酶解时间６０　ｍｉｎ、酶加入量３００　Ｕ、料液比１：３的条件　

下用木瓜蛋白酶对方格星虫进行水解，测定酶解　液对羟自由基的清除率，考察酶解温度、酶解ｐＨ、　

酶加入量、酶解时间、料液比等５个因素对羟自由　基清除率的影响，确定其最佳酶解条件。在此基　础上恒定酶解液ｐＨ值为７．０的条件下，选择加酶　量、酶解温度、酶解时间、料液比进行正交试验，确　

定最优酶解条件。　１．３．５羟自由基清除率的测定　清除羟自由　基的研究采用甲基紫褪色法－８　Ｊ。其基本原理是：　

Ｏ２一・和Ｆｅ发生Ｆｅｎｔｏｎ产生・ＯＨ。・ＯＨ容易进　

攻高电子云密度点，会与甲基紫中具有高电子云　

密的．Ｃ＝Ｃ一基团发生亲电加成反应，而使甲基紫褪　色。通过测定甲基紫吸光度值的变化可间接测定　

出・ＯＨ的生成量。方法：按表１的方法加样，用　ｐＨ为３．２－３．７的Ｔｒｉｓ—ＨＣ１的缓冲溶液调节反应体　系ｐＨ为４．７，最终体积是１０．０　ｍＬ，然后在５７８ｎｍ　

波长下比色，测得吸光度值，计算清除率：　清除率（％）＝［（Ａ　－，４。）／（Ａ－Ａ。）］×１００（式　

中：　．样品组吸光度；Ａ。．空白组吸光度；Ａ一对照组　吸光度。Ａ，为加甲基紫，其余均不加在５７８ｎｍ波　长下比色，测得的吸光度值；　。不加样品，其余均　加在上述相同条件下测得的吸光度值；Ａ加样品，　

同时其余均加在上述相同条件下测得吸光度值）。　甲基紫清除羟自由基的加样程序见表２。　

表２　甲基紫清除羟自由基的加样程序　Ｔａｂｌｅ　２　Ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅ　ｐｒｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｍｅｔｈｙｌ　ｖｉｏｌｅｔ　ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ　ｈｙｄｒｏｘｙｌ　ｆｒｅｅ　ｒａｄｉｃａｌ

　第９期　朱银玲等：酶解法制备方格星虫多肽及其抗氧化作用研究　１３９９　

２结果与讨论　

２．１单因素实验　２．１．１　木瓜蛋白酶加入量对羟自由基清除率的　

影响图１为酶加入量与自由基清除率的关系。　

由图可知，当酶加入量到达３００　Ｕ／ｇ时，自由基清　

除率达到最高。随酶加入量的增加而略有下降。　

这可能是因为随着酶浓度的上升，酶与底物的接　

触机会增加，蛋白质酶解速度提高，导致多肽更快　

地分离出来。达到饱和后，蛋白被酶解的速度趋　

于稳定，再增大加酶量也难以显著提高多肽得率。　

因此最适加酶量应在３００　Ｕ／ｇ左右。　ｌ００　

９５　

錾９０　

８５　

８Ｏ　０　ｌＯ０　２００　３Ｏ０　４００　５Ｏ０　６００　酶加入量（Ｕ／ｇ）　

图ｌ酶加入量对自由基清除率的影响　Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｘｙｌ　ｒａｄｉｃａｌ　ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ　ｒａｔｅ　

２．１．２温度对羟自由基清除率的影响　由图２　

可知，木瓜蛋白酶酶解液清除羟自由基的效率随　

温度升高而增加，５０ｃｃ时最大，随着温度的升高而　

下降。这可能是因为随着温度的逐渐增加，反应　

物的能量随之升高，反应速度加快，有利于酶解的　

快速进行；当超过一定温度后，酶的活力降低，甚　至完全失去活性，从而导致多肽得率下降。因此，　

最适酶解温度在５Ｏ℃左右。　１００　

９５　

９０　

８５　

８Ｏ　３０　４０　５０　６０　７Ｏ　温度（℃）　

图２温度对清除羟自由基的影响　Ｆｉｇ．２　ｒＩ１ｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　Ｏｉｌ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｃｌｅａｒｉｎｇ　ｕｐ　ｈｙｄｒｏｘｙｌ　ｒａｄｉｃａｌｓ　２．１．３酶解时间对羟自由基清除率的影响图３　的结果表明，当其他条件一定的情况下，木瓜蛋白　

酶酶解液清除羟自由基的能力随时间增加而增　

加，但当到达６０　ｍｉｎ时，随着时间的增长而下降。　这可能是因为提取时间过长，多肽发生降解以及　

酶液腐败造成的，因此，最佳酶解时间应在６０　ｍｉｎ　

左右。　

Ｖ　簪　

窿　

０　２０　４０　６０　８０　ｌＯ０　ｌ２０　１４０　时间（ｍｉｎ）　

图３　酶解时间对清除率的影响　Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆｔｉｍｅ　Ｏｉｌ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｃｌｅａｒｉｎｇ　ｕｐ　ｈｙｄｒｏｘｙｌ　ｒａｄｉｃａｌｓ　

２．１．４酸度对羟自由基清除率的影响　图４显　

示，酶解液清除羟自由基的效果随酸度增加而增　

加，但当到达ｐＨ＝７．０时，随着酸度的上升而下　

降。ｐＨ值过大时酶的活性较小，当ｐＨ值在７．０　左右时，酶的活性最高，与底物的亲和力最强，催　

化速度快，多肽得率最高。因此，最佳酶解ｐＨ值　

为７．０。　

５　５．５　６　６　５　７　７　５　８　ｐＨ　图４酸度对清除率的影响　Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ａｃｉｄｉｔｙ　ｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｃｌｅａｒｉｎｇ　ｕｐ　ｈｙｄｒｏｘｙｌ　ｒａｄｉｃａｌｓ　

２．１．５料液比对羟自由基清除率的影响　

图５表明，木瓜蛋白酶酶解液的清除羟自由　

基的效率随料液比增加而下降，但当到达１：３时，　

达到最大值，之后随着料液比的增加而增加。这　可能随着料液比的增加，一开始酶解液能与样品　

更能充分接触，当达到１：３过后，酶解液被稀释，降　

解率下降。因此采用的料液比为１：３。　∞　鲫　∞如　

如