转铁蛋白与RGD共修饰脂质体用于脑胶质瘤靶向性研究 邵云，俞向荣，吴一平，姚建社，羊正祥 (214023江苏无锡, 无锡市人民医院神经外科)

[通信作者] 邵云，E-mail： [摘要]目的：构建转铁蛋白与整合素受体RGD共修饰脂质体并对其脑胶质瘤靶向性进行初步研究。方法：采用薄膜分散法制备RGD修饰脂质体，采用后插入法制备转铁蛋白与RGD共修饰脂质体，观察其形态，粒径，电位。并通过U87脑胶质瘤细胞摄取实验以及裸鼠脑组织离体成像实验考察脂质体的脑胶质瘤靶向性。结果：所制备的双配体脂质体粒径在(120±8.5) nm，电位为（-5±1.15） mV。体外细胞摄取实验表明，U87脑胶质瘤细胞对共修饰脂质体的摄取效率分别是转铁蛋白修饰脂质体和RGD修饰脂质体的2.1倍和2.7倍。肿瘤球摄取实验以及裸鼠脑组织离体成像实验表明共修饰脂质体具有良好的肿瘤靶向性以及脑部肿瘤传递能力。结论：转铁蛋白与RGD共修饰脂质体具有一定的脑胶质瘤靶向性，是一种潜在的脑胶质瘤给药系统。 [关键词] 转铁蛋白；RGD；脂质体；脑胶质瘤

Transferrin and RGD co-modified liposome for glioma targeting SHAO Yun,YU Xiang-rong,WU Yi-ping,YAO Jian-she,YANG Zheng-xiang (Department of Neurosurgery , Wuxi People's Hospital , Wuxi 214023 ,China)

Abstract Objective: To prepare transferrin and RGD co-modified liposome and evaluate their glioma targeting efficiency in vitro and in vivo．Methods: The co-modified liposome was prepared by film-ultrasonic method. The appearance，particle size，Zeta potential were evaluated. The cellular uptake by U87 cells in vitro and vivo imaging were used to evaluate the targeting efficiency. Results: The particle diameter of the co-modified liposome was 120±8.5 nm with the Zeta potential of -5±1.15 mV. The result demonstrated that the co-modified liposome uptaken by U87 were 2.1, 2.7 times higher than that of transferrin modified liposome and RGD modified liposome, respectively. The evaluation of tumor spheroid penetration and in vivo imaging show the co-modified liposome has the strongest fluorescence intensity. Conclusion: The co-modified liposome might serve as a promising glioma delivery system of antitumor drugs. Key words: Transferrin; RGD; Liposome; Glioma

原发性中枢神经系统肿瘤的发病率不断增加，其中，神经胶质瘤占总发病数的77%～80%左右，是颅内最常见的恶性肿瘤[1]。手术治疗是脑胶质瘤临床治疗的首选方案。然而由于脑胶质瘤本身是侵润生长，不易与正常的脑组织区分，因此在手术过程中很难将肿瘤组织全部切除，为了杀伤肿瘤细胞还需要放射治疗和化疗。然而化疗药物很难到达脑部肿瘤组织还会产生很大的副作用。因此脑胶质瘤的治疗迫切需要新手段。 转铁蛋白受体是一种在正常细胞和肿瘤细胞表面都普遍存在的受体，但是在肿瘤细胞的表面（尤其是脑胶质瘤）转铁蛋白受体的表达是正常细胞的4～5倍[2]。整合素（Integrins）是一类细胞黏附受体分子，在有核细胞表面均广泛表

达，其中整合素αvβ3在神经胶质瘤、黑色素瘤、卵巢癌等多种肿瘤细胞及肿瘤相关的内皮细胞表面高度表达，与肿瘤的血管发生，肿瘤转移及肿瘤的抗放射治疗密切相关，因此整合素αvβ3常被用作肿瘤靶向的特异性靶点。已有研究表明，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp, RGD）的三肽序列能够特异性地识别含αv亚基的整合素家族，具有高度亲和力[3]。脂质体是由磷脂组成的具有双层膜结构的球形结构。能够在水相包载亲水性的药物，也能在脂质双层包载亲脂性的药物同时，脂质体可以很容易进行表面修饰，可以引入PEG延长循环时间，达到长循环的效果，也可以连接配体成为主动靶向脂质体。 本研究成功制备了转铁蛋白（TF）与RGD共修饰的脂质体，并对共修饰脂质体的靶向性进行了体内外评价。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂与仪器 Sizer Nano ZS90型激光粒度仪及ZETA电位分析仪（英国Malvern instruments Ltd）。RGD peptide (成都凯捷生物公司)；大豆磷脂（SPC，上海太伟药业有限公司）；DSPE-PEG2000（美国Avanti polar lipids公司）；胆固醇（Cho，美国sigma公司）；DMEM高糖培养基（美国GIBCO公司）；转铁蛋白（美国sigma公司）；香豆素-6（美国sigma公司）；DSPE-PEG2000-MAL (美国sigma公司)；其余试剂为分析纯。人脑胶质瘤细胞(U87,上海细胞研究所)。 1.2 方法 1.2.1 RGD修饰脂质体的制备 参照文献[4]方法合成DEPE-PEG2000-RGD。使用薄膜分散法制备RGD修饰脂质体。将处方量的香豆素-6，SPC，Cho，DSPE-PEG2000-RGD，DSPE-PEG-OMe（保证总磷脂：胆固醇=70:30（molar ratio），分别溶于氯仿，置50ml茄形瓶中旋转蒸发成膜后，再置真空干燥器中过夜。加入2.5 mL PBS缓冲液（pH7.4），置空气浴摇床中，37℃，180rpm，20min水化，水浴超声5min脱膜，探头超声(80 W×5 s×15次)制备得到RGD修饰的脂质体（RGD-LP）。 1.2.2 转铁蛋白修饰脂质体的制备 转铁蛋白修饰脂质体（TF-LP）分五步进行。第一步是采用同于“1.2.1”的方法制备普通脂质体。 第二步：精密称取适量转铁蛋白，用巯基化反应液溶解并使其浓度为12 mg·ml-1，精密称取适量Traut’s reagent同样以巯基化反应液溶解并使其浓度为2 mg·ml-1。将二者混合并使TF：Traut’s reagent=1:5（摩尔比），在微型振荡器中避光反应125rpm，25℃，1h，得到巯基化的转铁蛋白（TF-SH）。将反应后得到的TF-SH溶液过G50葡聚糖凝胶柱（1×20cm）分离TF-SH和游离的Traut’s reagent。 第三步：精密称取一定量Mal- DSPE-PEG2000溶于氯仿中，在茄形瓶中减压蒸馏成膜，除去有机溶剂，置于真空干燥器中过夜，使其充分干燥，加入适量PBS水化，制备Mal-DSPE-PEG2000胶束。 第四步：将第二步制备好的TF-SH与第三步制备好的Mal- DSPE-PEG2000胶束按照一定比例混合（TF-SH：Mal- DSPE-PEG2000=1:10，摩尔比）在微型振荡器中避光反应 125rpm，25℃，4h，使TF-SH中的-SH与Mal- DSPE-PEG2000中的Mal相结合，反应完后加入适量10mg·ml-1的2-MEA溶液（并使溶液中2-MEA最终浓度为1mM），继续反应30min，使2-MEA上-SH与TF-SH上-SH竞争性结合Mal- DSPE-PEG2000上的Mal，以反应掉剩余Mal-DSPE-PEG2000。最终得到TF-Mal-PEG2000胶束。 第五步：将第一步制备的普通脂质体与第四步得到的TF-Mal-PEG2000胶束按照脂质材料：胶束=50:1（摩尔比）比例混合后，微型振荡器中避光反应 150rpm，37℃，1h。反应后溶液过CL-4B琼脂糖凝胶柱（1×20cm）除去游离的TF-Mal-PEG2000胶束，得到转铁蛋白修饰的长循环脂质体。 1.2.3 转铁蛋白与RGD共修饰脂质体的制备 取“1.2.1”项制备的RGD修饰脂质体与“1.2.2”项第四步制备的TF-Mal-PEG2000胶束按照“1.2.2”项第五步方法制备得到TF与RGD共修饰的脂质体（RGD/TF-LP）。 1.2.4 共修饰脂质体的形态，粒径和Zeta电位 将共修饰的脂质体用磷钨酸染色，采用透射电镜（TEM）观察形态。另取适量样品用粒度仪测定其粒径以及电位。 1.2.5 不同脂质体体外细胞摄取实验 将U87细胞按每孔1×105个细胞接种于含10%血清24孔板中，培养24 h后，在孔板中加入样品RGD-LP,TF-LP和 RGD/TF-LP，每个孔加入100μL，于CO2培养箱中分别孵育2 h，弃去培养基，加入适量PBS清洗3次，加入1 mL1%triton-100裂解细胞，4℃避光裂解0.5 h以上，待裂解完全后，取各组样品各200 μL在Ex=465 nm、 Em=502 nm用荧光分光光度计测定的荧光强度。 1.2.6 U87脑胶质瘤细胞体外肿瘤球模型的构建以及对脂质体的摄取考察 取对数生长期的U87细胞用0.125%胰酶消化后，用含血清的培养基中和胰