△通信作者。E－mail：yijiqun@139．com人肺腺癌细胞HCC4006对厄洛替尼耐药细胞株的建立及其耐药机制鉴定梁继珍，李理，易基群△广州市红十字会医院肿瘤科（广东广州510220）【摘要】目的建立人肺腺癌EGFＲ敏感突变细胞HCC4006对厄洛替尼耐药细胞株，并初步鉴定其耐药机制。方法厄洛替尼采用梯度递增的方式处理HCC4006细胞，直至HCC4006在厄洛替尼8μmol/L浓度下，生长速度接近HCC4006细胞，视为HCC4006厄洛替尼耐药细胞株即HCC4006EＲ；使用MTT法分别检测厄洛替尼、阿伐替尼对HCC4006、HCC4006EＲ细胞的增殖抑制作用；计算HCC4006、HCC4006EＲ对厄洛替尼、阿伐替尼的IC50值及耐药指数；显微镜下观察HCC4006EＲ细胞形态变化，并使用免疫印迹法检测常见上皮间质转化标志在HCC4006及HCC4006EＲ中的蛋白表达水平。结果HCC4006EＲ细胞对厄洛替尼耐药，其IC50值为（11393.33±18.95）μmol/L，是HCC4006的260.84倍；HCC4006EＲ细胞对第2代EGFＲ－TKI阿伐替尼具有交叉耐药（耐药指数为258.78）；HCC4006EＲ较HCC4006细胞呈现上皮间质转化形态改变，其间质标志ZEB1、N－cadherin、vimentin升高而上皮标志E－cadherin、ESＲP1/2蛋白下降。结论成功建立对厄洛替尼耐药的HCC4006EＲ细胞株，且其对阿伐替尼具有交叉耐药；HCC4006EＲ针对EGFＲ－TKI的耐药可能与上皮间质转化有关。【关键词】非小细胞肺癌；肿瘤抗药性；表皮生长因子受体－酪氨酸激酶抑制剂肺癌是目前全球死亡人数最高的恶性肿瘤，其中85%的肺癌为非小细胞肺癌（NSCLC），大约2/3的NSCLC患者存在致癌驱动基因，其中一半的患者具有治疗价值的靶点，而最为常见的驱动基因事件为表皮生长因子受体（EGFＲ）突变［1－2］。目前靶向EGFＲ的酪氨酸激酶抑制剂（TKI）药物已发展为3代药物：包括第1代药物吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼等，第2药物阿伐替尼，第3代药物奥希替尼等。EGFＲ－TKI的临床应用将EGFＲ突变型晚期NSCLC中位生存时间由8～10个月延长为3年以上［3］。但是部分靶向治疗患者在治疗的过程中不可避免地出现耐药。建立EGFＲ－TKI耐药细胞株并进一步研究其耐药机制具有重要的现实意义。本研究于2017年2—8月选择存在EGFＲ19外显子缺失突变的人肺腺癌细胞株HCC4006，使用第1代EGFＲ－TKI厄洛替尼处理，建立对厄洛替尼耐药的细胞株并初步评估其耐药机制，为后续相关研究提供基础。1材料与方法1．1实验材料人肺腺癌细胞株HCC4006由南方医科大学惠赠；HCC4006于含10%FBS、1%青霉素链霉素的ＲPMI1640培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱内培养，4d左右传代1次。厄洛替尼、阿伐替尼分别由瑞士罗氏公司、德国勃林格殷格翰公司赠予；分别使用DMSO溶解成8mmol/L、20mmol/L浓度备用。使用抗体如下：鼠抗人N－cadherin（sc－8426，SantaCruz）、鼠抗人ESＲP1/2（210－301－c31，Ｒockland）、兔抗人ZEB1（3396，CellSignaling）、鼠抗人N－cadherin（sc－8424，SantaCruz）、vimentin（ab137321，Abcam）；辣根过氧化酶标记鼠抗（31420）及兔抗（A18903）IgG二抗，ECL显色试剂盒购自ThermoFisherScientific。1．2耐药细胞株的构建梯度递增使用2nmol/L、20nmol/L、200nmol/L、2μmol/L、8μmol/L浓度的厄洛替尼处理HCC4006细胞，药物处理72h后更换为不含药物培养基，待细胞生长至80%满盘时再次使用药物处理，当细胞在该浓度药物作用下生长速度接近HCC4006母代细胞时升级为下一浓度梯度；耐受8μmol/L厄洛替尼浓度的HCC4006细胞，持续维持在含8μmol/L厄洛替尼的培养基培养并传代10代以上，视为HCC4006厄洛替尼耐药细胞株，即HCC4006EＲ。1．3MTT法检测药物对细胞的增殖抑制参考文献报道厄洛替尼、阿伐替尼用药浓度梯度分别为5、15、45、135、405、1215nmol/L和3、9、27、81、243、729nmol/L［4］。MTT实验方法如下：收集对数期细胞，·33·广东医学2018年5月第39卷（增刊）GuangdongMedicalJournalMay2018，Vol．39，Suppl．DOI:10.13820/j.cnki.gdyx.2018.s1.010计数，96孔板中每孔加入1000个细胞，细胞悬液体积为100μL；37℃、5%CO2培养箱内培养过夜，细胞贴壁后加入浓度梯度的药物，每孔100μL，设4个复孔；37℃、5%CO2培养箱内培养72h，显微镜下观察药物对细胞的增殖抑制；药物作用72h后每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，即0.5%MTT），继续培养4h；终止培养，小心吸去孔内培养液；每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值；同时设置对照孔（细胞、培养液、MTT、DMSO）；以上实验重复3次；计算增殖抑制率及半数抑制浓度IC50值。IC50计算公式如下：lgIC50=Xm－I［P－（3－Pm－Pn）/4］。其中：Xm：lg最大剂量；I：lg（最大剂量/相临剂量）；P：阳性反应率之和；Pm：最大阳性反应率；Pn：最小阳性反应率；公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率。耐药指数=HCC400EＲ细胞IC50值/HCC4006细胞IC50值。1．4免疫印迹法检测蛋白表达用细胞裂解液分别处理收集的HCC400、HCC4006EＲ，提取细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。各组细胞总蛋白经常规变性后，用8%或12%SDS－PAGE分离目的蛋白，然后采用湿转印法将蛋白转印至聚偏二氟乙烯（polyvinylidenedifluoride，PVDF）膜上；用5%脱脂牛奶于室温封闭1h，加入兔/鼠抗人抗体（1∶1000），4℃反应过夜；TBST洗膜后，加入HＲP兔/鼠IgG二抗（1∶3000），室温反应1h；洗膜后，采用ECL试剂检测不同细胞组中EMT标志的表达水平，以actin为内参蛋白进行校正。1．5统计学方法计量资料采用珋x±s表示，采用微软excel2016软件进行绘图及计算。2结果2．1厄洛替尼对HCC400EＲ细胞的增殖抑制通过MTT法检测厄洛替尼对HCC4006及HCC400EＲ的增殖抑制作用，发现HCC4006EＲ对厄洛替尼获得显著的抗性，其IC50值分别为（11393.33±18.95）nmol/L、（43.68±0.34）nmol/L；HCC400EＲ对厄洛替尼的IC50值是其亲本细胞HCC4006的31.90倍。见图1－A和表1。2．2阿伐替尼对HCC400EＲ细胞的增殖抑制阿伐替尼作为第2代EGFＲ－TKI，对HCC400EＲ的增殖抑制作用也受到影响；增殖抑制曲线表明，HCC4006EＲ及HCC4006对阿伐替尼的敏感性存在显著差异；发现HCC4006EＲ对厄洛替尼获得显著的抗性，其IC50值分别为（1201.90±7.89）nmol/L、（4.64±0.29）nmol/L；HCC400EＲ对阿伐替尼的耐药指数高达258.78倍。见图1－B和表1。2．3HCC4006EＲ细胞形态学改变通过厄洛替尼梯度浓度递增处理后的HCC4006耐药细胞株，即HCC4006EＲ较其母代细胞HCC4006呈现出不同的细胞表型；显微镜下观察HCC4006细胞形态多为类椭圆形的典型上皮细胞形态，而HCC4006EＲ呈现逐渐向长梭形形态改变且连接松散，符合间质细胞形态学改变。见图2。2．4上皮间质转化标志在HCC400EＲ及HCC4006中的表达使用免疫印迹法检测HCC400EＲ及HCC4006中上皮标志CDH1、ESＲP1/2及间质标志ZEB1、CDH2、vimentin的蛋白水平，发现上皮标志在耐药细胞株HCC400EＲ中明显下降，而间质标志均有升高。见图3。

图1厄洛替尼、阿伐替尼浓度－细胞增殖抑制率曲线图3讨论EGFＲ突变作为肺腺癌最常见的驱动基因事件，靶向EGFＲ基因的EGFＲ－TKI治疗是晚期肺癌药物治疗领域近10余年来的突破性进展，极大地改善了晚期肺癌患者的生存及预后。EGFＲ突变常见的有19del、21L858Ｒ、20ins等，其中治疗效果最佳的为19del突变。而EGFＲ－TKI药物已经历如下的发展历程：非共价抑制剂（第1代）、共价抑制剂（第2代）、野生型及特定突变型（20T790M）有效的第3代药物。目前临床使用最为广泛的是第1代药物，中位无进展生存时间（PFS）为8～10个月，而奥·43·广东医学2018年5月第39卷（增刊）GuangdongMedicalJournalMay2018，Vol．39，Suppl．

A：HCC4006；B：HCC4006EＲ图2显微镜下观察HCC4006/HCC4006EＲ细胞形态变化（×100）表1厄洛替尼、阿伐替尼作用HCC4006及HCC4006EＲ细胞的IC50值及耐药指数珋x±sEGFＲ－TKIsIC50（nmol/L）HCC4006HCC4006EＲ耐药指数厄洛替尼43．68±0．3411393．33±18．95260．84阿伐替尼4．64±0．291201．90±7．89258．78

图3EMT标志在HCC4006EＲ及HCC4006细胞中的蛋白表达（上皮标志E－cadherin、ESＲP1/2，间质标志ZEB1、N－cadher-in、vimentin）希替尼的临床应用已将整体EGFＲ突变人群的中位PFS延长至18个左右［3］，但是所有的治疗有效人群都随时面临着耐药的难题。肺癌是一组异质性明显的疾病，除传统的病理学分类之外，同一病理亚型甚至同一分子亚型之间也存在很大的生物学差异及临床转归差异［5］。从生物机制方面的研究来看，EGFＲ－TKI耐药的主要机制分为靶点内耐药和靶点外突变，前者包括EG-FＲ基因二次突变（20T790M）、EGFＲ蛋白的扩增或缺失，后者主要是其他信号通路的激活，包括下游信号或旁路信号的活化。而除此之外，还有一些细胞形态改变导致的耐药机制有待进一步研究，包括上皮间质转化和小细胞转化［6］。针对EGFＲ20T790M突变已开发出第3代EGFＲ－TKI奥希替尼并在临床应用；针对EGFＲ蛋白水平的变化可通过联合使用EGFＲ单抗来逆转，而针对其他信号通路的活化可通过其他靶向信号通路药物的联合来对抗耐药。阿伐替尼作为第2代EGFＲ－TKI，其可与EGFＲ共价结合［7］，较第1代TKI具有更低的IC50值，本实验得到的数据也符合理论分析及既往报道，但是一旦EGFＲ敏感突变细胞对一代TKI耐药后往往也意味着对二代药物的交叉耐药，我们的细胞模型证实了一代及二代TKI的交叉耐药存在，提示在临床过程中应尽可能不要尝试将二代TKI用于一代TKI耐药的患者。在临床实践中将EGFＲ－TKI治疗失败的晚期肺癌患者分为3类：缓慢进展、寡转移及快速进展，针对不同的进展类型采用继续用药、局部治疗及更换治疗药物的不同处理方式［8］。对于缓慢进展及寡转移人群的病情能够得到很好的控制，而快速进展的人群目前的治疗疗效仍不满意。故我们设想以EMT为代表的细胞表型转化可能对应着EGFＲ－TKI治疗失败后快速进展的肺癌患者，此类患者往往意味着快速的侵袭及转移能力，而其发生机制及调控值得进一步研究。EMT是一种分化良好、极化状态且紧密连接的上皮细胞转化更具侵袭性间质表型的过程，我们在构建HCC4006EＲ细胞的过程中，观察到其较亲本细胞存在典型的EMT细胞形态的改变，表现为耐药细胞呈现长梭形且细胞连接变少，可能意味着耐药细胞更具侵袭性和转移能力。但是也有研究认为EMT非肿瘤转移所必须，但是与化疗耐药有关［9］。但EMT意味着更恶性的生物学行为及更差的临床预后是无明显争议的。在EMT的过程中伴随着相关上皮标志的下降和间质标志的升高，我们构建的HCC400EＲ细胞中相关蛋白的变化符合EMT的表现，进一步证实其EMT表型的存在。关于EMT的调控，近年关注的一个重要转录因子是ZEB1，其可直接直至E－cadherin的表达，我们通过免疫印迹法发现其在HCC400EＲ细胞中过表达，与既往的研究［10］结果一致。此外，通过miＲNA、lncＲNA等非编·53·广东医学2018年5月第39卷（增刊）GuangdongMedicalJournalMay2018，Vol．39，Suppl．