– 加入标准量补体 – 加入包被抗体的红细胞 – 检测红细胞溶解情况
（2个系统，5种成分）
• 已知抗原加入血清（检测抗体）
Ab
Ag
No Ab
Patient’s serum
Ag
四、免疫标记技术
免疫标记技术是采用酶、荧光素、放射 性核素等标记物标记抗原或抗体所进行 的抗原抗体反应。 免疫标记技术既可对样品作定性、定量 检测，也可进行定位分析，且大大提高 了方法的灵敏度，是目前应用最广泛的 免疫学检测技术。
适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗 原及低于二价的小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心
2 间接法测抗体
几种标记/检测技术灵敏度的比较
灵敏度(mol/L)
10-18
10-15
10-12
10-9
酶标 荧光
放免
发光
几种标记/检测试剂的有效期比较
有效期（月）
18
15 12 9 6
火箭电泳图
沉淀线的高度与抗原量成正比
二、凝集反应（Agglutination）
颗粒性抗原（如细菌、细胞）与相应抗体，在适当电解 质存在的条件下，经过一定时间后出现肉眼可见凝集块 称为凝集反应。
1、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出 现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法和试管法。
血清免疫电泳
将抗原混合物（病人血清）在凝胶中用电泳 分离后，沿电泳方向挖一平行的小槽，加入 抗血清，进行双向扩散。沉淀线的特点显示 病人血清与正常人血清存在的差异，即血清 蛋白组分的缺少或增加。
免疫电泳原理图解
火箭免疫电泳
火箭免疫电泳技术又称作单向电泳扩散 免疫沉淀试验，它是由单向扩散发展起 来的一项定量技术，实质上是加速度的 单向扩散。
①特异性：抗原抗体反应具有高度的特异性。
②可逆性：抗原抗体反应所形成的复合物较稳定，
但在一定条件下可解离。（低酸、高盐）
③比例性：抗原抗体的比例合适，才可出现可见的
反应现象。（网格理论） ④阶段性：特异性结合阶段和可见反应阶段。
网格理论——解释抗原抗体形成沉淀的机制
抗体过剩
抗体抗体比例合适
抗原过剩
2. 凝胶扩散沉淀
凝胶扩散沉淀是指抗原与抗体在凝胶介质中自由扩 散形成浓度梯度，抗原与抗体在比例合适的扩散部 位相遇形成沉淀线的反应。 常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺 凝胶等。 最常用的方法为： ①单向琼脂扩散试验 ②双向琼脂扩散试验
单向琼脂扩散试验
原 理：
将适当浓度的抗体混入琼脂凝胶中，琼脂 凝固后，打成小孔，加入待测的抗原物质， 使抗原在凝胶中由小孔自由向周围扩散，并 在小孔周围合适的位置与抗体结合形成沉 淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。
单向免疫扩散试验示意图
双向免疫扩散试验
双向免疫扩散试验是在琼脂板上按一定距离 打数个小孔，在相邻的两孔内分别放入抗原 和抗体材料。当抗原和抗体向四周凝胶中扩 散，在两孔间可出现2～3条沉淀线，本法常 用于抗原或抗体的定性或定量检测，或用于 两种抗原材料的抗原相关性分析。
3.免疫电泳技术
免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。 这种技术有两大优点：一是加快了沉淀反应的速度， 二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分 开，再分别与抗体反应，以此作更细微的分析。 免疫电泳包括:血清免疫电泳、对流免疫电泳、 火箭电泳、免疫印迹等
酶联免疫吸附试验（ELISA）：
是在固相载体（通常为聚苯乙烯反应板）表面进行 的抗原抗体反应。 实验中常用的酶是辣根过氧化物酶（HRP），底物 为二苯基联苯胺。
ELISA试验三个必要的试剂

(1)固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） (2)酶标记的抗原或抗体（标记物） (3)酶作用的底物（显色剂）
第九章
免疫检测技术

免疫检测是目前生物学检测方法中 用途最广泛的一种方法。
具有高度精确、灵敏、特异的特点。

可用于免疫学的基础理论和应用研 究，也可应用于生物学研究的各个 领域。
免疫检测技术在生物科学领域中的应用：
1 2 3 4 5 6 7 、免疫疾病诊断 、动物植物生理活动研究（激素、维生素） 、物种及微生物鉴定 、动物、植物性状的免疫标记 、免疫增强药物和疫苗的研究 、发病机理研究 、分子生物学研究
基本步骤
原理
1
包被
2
反应
加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体
3
洗涤
使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离
4
底物显色
定性或定量的分析
五种常见的检测方法
1 2 3 4 5 双抗夹心法（测定抗原） 测定抗体的间接法 竞争法（测定抗原） 捕获包被法测IgM抗体 ABS-ELISA法
1 双抗夹心法测抗原
PtK1细胞免疫荧光染色
用抗α-tubulin抗体染色显示微管(绿色); 细胞核: 红色, DAPI染色(激光共聚焦显 微镜照片)
3. 免疫酶测定法
本法是抗原抗体反应的特异性与酶对底物的高效催 化活性相结合的免疫检测技术。酶标记的抗原或抗 体与待检标本中的相应成分特异性结合，根据酶作 用底物后的颜色变化，采用肉眼或酶标检测仪分 析、判断结果。 常用方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫组化法，前 者用于检测可溶性抗原或抗体，后者常用于检测组 织中或细胞表面的抗原。
用Alexa488标记的抗人α-tubulin抗体染色显示微 管(绿色); 细胞核: 红色, DAPI染色
常用于抗原、抗体标记的荧光染料有以下几种
显示绿色荧光：Fluorescein isothocyancie(FITC),Alexa-488 显示红色荧光：Rhodamine B, Texas Red, Alexa-546,568,594 显示蓝色荧光：Alexa－350
(RIA)
RIA法原理及标准曲线
Ag*-Ab
结 合 未 结 合 的 放 射 活 性 （ ）
Ag*
75 50 30 10 0 1 10 L)
2. 免疫荧光技术
将荧光素（异硫氰酸荧光素或罗丹明等）标记抗体， 制成荧光抗体诊断试剂。 用荧光显微镜观察荧光的产生或荧光强度，以此判断 抗原的存在、定位和分布情况。 免疫荧光技术有直接法和间接法等。
参与，否则不出现可见反应。
三、抗原抗体反应类型
1.沉淀反应 2.凝集反应 3.补体参与的反应 4.中和反应 5.免疫标记技术
第二节
常见免疫检测方法
一、免疫沉淀反应
可溶性抗原（血清蛋白、病毒抗原、细胞裂解液 或组织液等）与相应抗体结合，在一定条件下形 成肉眼可见的沉淀物称沉淀反应。
一、免疫沉淀反应
放射免疫分析－基本原理
竞争性结合反应的经 典标记抗原（Ag*）和 非标记抗原（Ag）与限 量抗体(Ab)竞争性结合 Ag*和Ag具有等同的
与Ab结合能力
放 射 免 疫 测 定 法 示 意 图
Ag* 标记抗原
Ab 特异性抗体
Ag 待测抗原
( Ag*-Ab)+ (Ag-Ab) 抗原抗体复合物 分离Ag*-Ab 和游离Ag* 测定Ag*-Ab和游离Ag*放射性 从标准曲线上读知含量
四、免疫标记技术 常见标记免疫技术
放射免疫技术 酶免疫技术
荧光免疫技术
1. 放射免疫技术（125I）
该法是用放射性核素作为标记物标记抗原或抗体 所进行的抗原抗体反应，尽管放射免疫技术需特殊 仪器设备且有一定的放射性危害，但由于其具有高 度的灵敏度（pg）和自动化检测等特点，因此在实 验研究和临床检测中仍被广泛应用。 主要用于激素、小分子药物、肿瘤标志物等 小分子化合物的定量分析。


ABS-ELISA法
①：固相支持物； ②：样品； ③：特异性IgG； ④：生物素化抗小鼠IgG （Biotin）； ⑤：辣根过氧化物酶HRP-酶标链亲和素（Avidin）； ⑥：DAB显色液； ⑦：显色；
絮状沉淀
1. 液相沉淀反应
环状沉淀 免疫浊度沉淀
单向琼脂扩散试验
2. 凝胶扩散沉淀
双向琼脂扩散试验 血清免疫电泳
3. 凝胶免疫电泳
火箭电泳 对流免疫电泳
免疫印迹等
絮状沉淀试验
操作步骤：
（1） 将可溶性抗原作一系列倍比稀释。 （2） 各管加入一定浓度的适量抗血清。 （3） 振摇使抗原、抗体充分混匀，置37℃孵育。 （4） 产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物最多的管 为最适比例管。 絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，目前 多用以测定抗原抗体反应的最适比。
第一节 抗原抗体反应原理
抗体能特异性地识别相应的抗原，并与之结合。这种 结合在体外也能发生，当抗原和抗体在体外特异性结合后 可出现肉眼可见或借助仪器可检测出的反应现象。 这种特性就是许多免疫检测方法的基础!! 试验时既可用已知抗体检测标本中有无相应抗原，也可
用已知抗原检测标本中有无相应抗体。
一、体外抗原抗体反应的特点
2、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面， 与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。
妊娠免疫诊断试验

孕妇尿中，绒毛膜促性腺激素（HCG）含量 明显增高。（HCG是可溶性抗原 ）
反之，非孕妇尿中HCG含量甚微，不足以消 耗掉抗HCG抗体。

三、补体结合实验
（2个系统，5种成分）
三、补体结合实验
4 捕获包被法测IgM抗体

血清标本中的IgM包括针对抗原的特异性IgM抗 体和非特异性的IgM

加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性 IgM结合 抗人IgM抗体包被 加入血清标本 加入特异 性抗原试剂 加入针对特异性抗原的酶标抗体 加底物显色

捕获法
原理：
抗人IgMμ链抗体包被 捕获待测标本中IgM类抗体 加入特异性抗原和酶标记特 异性抗原的抗体