实验七 高效液相色谱法分离芳香烃
一、实验目的
1、了解高效液相色谱法的原理。

2、学习高效液相色谱的操作方法。

3、掌握高效液相色谱法分离芳香烃的一般步骤及过程。

二、实验原理
色谱法是利用不同物质在固定相和流动相中具有不同的分配系数，当两相作相对移动时，使这些物质在两相间进行反复多次分配，使原来微小的分配差异产生了很明显的分离效果，从而依先后顺序流出色谱柱，通过适当的检测手段，对分离后的各组分进行测定。

高效液相色谱是选用颗粒很细的高效固定相，采用高压泵输送流动相，分离、分析、定性及定量全部分析过程都通过仪器来完成的一种重要液相色谱法。

除了有快速、高效的特点外，它能分离沸点高、分子量大、热稳定性差的试样。

它的定性方法是用与标准品对照的方法，即采用保留时间对照法，当某两种物质在相同的色谱条件下保留时间相同时，就认为是同一种物质。

它的定量方法有很多，如外标法、内标法、面积归一法等。

我们采用面积归一法，即用一定量的标准品进样，记录其峰面积，然后进未知样品，根据未知样品的峰面积与标准品的面积比，计算某物质的含量。

计算公式：
其中W i 是未知物中被测物的浓度或质量，W s 是标准品的浓度或质量， A i 、A s 分别是被测物和标准品的峰面积（设定两者进样量相同）。

三、高效液相色谱仪的构造（Waters 600E 高效液相色谱仪）
1、高压输液系统：贮液器、高压泵、过滤器和梯度洗脱装置
2、进样系统
3、分离系统：柱系统（150 mm× 4.6 mm ，n -C 18柱）
4、检测器： 2487紫外检测器
5、控制和数据处理系统
W i =A i W s A s
四、试剂
1、流动相：80% 甲醇（色谱纯）+ 20% 水（经0.45μm膜过滤）（使用前超声波脱气）。

2、微量注射器：50 μL。

3、苯、甲苯（均为A.R）、二甲苯；样品（苯、甲苯、二甲苯）混合物均用甲醇（色谱纯）配制
五、实验步骤
1、接通电源，启动四元高压泵。

设定A泵为运行泵、流速为0.8 mL/min，用流动相平衡色谱柱30 min。

2、打开紫外检测器，输入所需波长：254 nm。

3、打开电脑，在开始→ 程序→ M32打开操作程序。

进行方法设置
4、点击moniter，监视基线5—10 min。

5、基线平稳后，点击工作栏上方的“停止”键，点击“进样”键。

6、用微量注射器抽取40—50μL标样，针头朝上排出气泡后，扎入进样孔（进样阀柄应处于向上位置），快速注射，迅速将进样阀柄扳下。

7、待样品峰全部显示后，再进行标样2及样品的测试（按6、7步进行）。

8、点击工作栏上方的“查看”，进行保留时间、面积积分记录。

9、实验做完后，用甲醇作流动相，冲洗色谱柱30 min，进行封柱。

10、关机：先关程序，然后关紫外检测器、四元高压泵，最后关电源。

六、数据处理
1、测定每一个标准样品的保留时间和峰面积。

2、测定未知样中每一个峰的保留时间，与标准样色谱图比较，标出未知样中每一个峰代表什么化合物。

3、测定未知样中每一个峰的峰面积，用标准样品的峰面积，计算未知样中相应化合物的含量。

七、思考题
1、在该色谱条件下，苯、甲苯和二甲苯的保留时间各是多少？
2、如何确定混合样中各组分的含量？。