IPG 胶条支架
IPG 胶条 定位
泡涨目的：使样品能完全以可溶形式进入 IPG胶条内
蛋白载样量
IPG胶条对蛋白载样量的影响因素：

待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析待研究蛋白的丰度 样品的复杂度
复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能 完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。

当溴酚蓝跑至分离胶末端时，停止电泳。

完成电泳后，凝胶浸泡于转膜缓冲液中，轻摇20min

除去电泳缓冲液中的盐与去污剂
转膜

按“黑板- 纤维垫子- 滤纸- 胶 - 膜 - 滤纸- 纤维板子- 白板” 配好 在膜的反面标字，标上点样孔和分离胶的位置 然后，将转膜夹放入转膜槽中，电泳


强碱性蛋白(如核糖体)的处理
• 预处理富集 • 特殊pH梯度的IPG胶条（如pH3－12、4-12或10-12）进行等电聚焦
极端分子量蛋白的处理
• 小于8kD 对流混合，产生绒毛状或模糊的带 • 大于200kD的蛋白，变性为多肽
固定pH 梯度(IPG)示意图
丙烯酰胺单体 酸缓冲基团：COOR 碱缓冲基团： NH3+
使被分离的 蛋白质与SDS 完整结合
SDS
IPG 胶条
标记纸片
向电泳缓冲液中加 0.5%的琼脂糖
SDS-PAGE
SDS-PAGE
SDS-PAGE
染色方法

胶体考马斯亮蓝染色
灵敏度为30~100ng，线性范围是20倍 可实现PAGE的无背景染色 会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果

胺基黑染色
转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）上的蛋白质的染色
易碎的细胞 坚硬的组织 植物细胞 真菌
温和
方法
剧烈
温和破碎法

渗透压冲击(培养的细胞)
低渗液中的悬浮细胞

反复冻融法(细菌)
液氮冷冻

去污剂降解(酵母、霉菌)
降解缓冲液(含尿素和去污剂) SDS(应在IEF前去除)

酶降解(植物、细菌、真菌)
溶菌酶(细菌) 纤维素酶，果胶酶(植物) 溶壁酶(酵母)


IPG胶条的pH范围
预试验确定 先宽后窄 先线性后非线性 先短后长
第一向：等点聚 焦 1. 放臵电极垫 (?)
2. 200 V 3. 500 V 维持 维持 1.5h
支架盖
电极 垫
1.5h 1500vh
IPG 胶条 电极
4. 1000 V 梯度上升 5. 8000 V 梯度上升 (?) 36000vh
CH2 = CH-C-NH-R O
聚丙烯酰胺凝胶
宽pH梯度及窄pH梯度
宽pH梯度用于：
全部蛋白 (确定感兴趣蛋白的 大致位臵)


窄pH梯度用于：
提高分辨率
增加载样能力以检测、分析 更多蛋白
IPG 胶的重泡涨及上样
2-DE 样品 重泡涨溶液
重泡涨溶液：
8M 2% 2% 0.28% 微量 尿素 NP-40 或 CHAPS IPG缓冲液 (两亲性电解液) DTT 溴酚蓝
IPG 胶条的平衡

平衡液
6 M 尿素和30% 甘油 减少电内渗

第一步平衡
加DTT 使变性的非烷基化蛋白处于还原状态

第二步平衡
加碘乙酰胺 使蛋白质巯烷基化，防止其在电泳过程中重新氧化
第二向: SDS-PAGE
• SDS 平衡 • SDS-PAGE
SDS 平衡液
50 mM 6M 30% 2% 微量 Tris-HCl 尿素 丙三醇 SDS 溴酚蓝
5% 乙酸 25% 甲醇
染色方法

负染
主要包括金属盐染料、锌－咪唑染料等的使用
能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率
速度快（5~15min）且能保持蛋白质的生物活性 不能用于膜上染色
适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析

胶体扩散染料
主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等 高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质 灵敏度与PAGE胶内的银染类似 不用于胶内染色


电泳 接好正负极开始电泳。30ma恒流电泳。


聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚 合而成的三维网状孔结构。 调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝 胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层 凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率


如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸 钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子 表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基 乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全 伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的 蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电 荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋 白质间所带电荷上的差异
Western blot 、蛋白 质双向电泳的原理、方法 及在医学中的应用

Western免疫印迹技术

准备工作 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
基本原理

蛋白质是两性电解质，在一定的 pH 条件下解离而带电 荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本 身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的 pH 小于 蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极 移动
两性电解质
pH 9 聚丙烯酰胺 pH 3 +
样品
-
等点聚焦 (第一向)
第二向
分子量
SDS-PAGE
pH 梯度(pI)
双向电泳具体步骤

样品制备
缓冲液的配制

IPG条重泡涨及上样


第一向：IEF
IPG条平衡
平衡缓冲液Ⅰ(还原) 平衡缓冲液Ⅱ(巯烷基化)

第二向：SDS-PAGE
胶条染色
成像及图像分析
为什么要进行样品制备 ？
目前双向电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白质 点(spot)，而样品中的蛋白种类可达到10万种以上。


待研究样本 ( 如临床样本 ) 常是各种细胞和组织混 杂，而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型。
样品制备原则
1 保证样品蛋白质完全溶解，分级效果好，干扰因素少
尽量使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋 白）。 避免样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解 等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检 测性。 通过超离心去除所有颗粒状物质，防止其堵塞凝胶孔路。

作用
去除杂质 浓缩样品 抑制蛋白酶活性
对于疏水性特别强的蛋白 如膜蛋白
硫脲 SDS 新型两性表面活性剂 (如磺基甜 菜碱)

关键-可溶性
获得可以重新溶解的蛋白

常用方法
硫酸铵沉淀 TCA沉淀 丙酮沉淀 TCA/丙酮沉淀 醋酸铵/甲醇/苯酚抽提
样品中杂质的去除

– 尽量不丢失蛋白 – 减少 – –
脂质
使蛋白质不易溶解且会影响其分子量及pI 丙酮沉淀

多糖
阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦 TCA、硫酸铵或醋酸铵/甲苯/苯酚沉淀；超速离心和高pH

– –
盐
使胶条导电能力增强，共聚焦不易发生 透析；胶体过滤；沉淀或重新悬浮

离子去污剂
如SDS，使蛋白质带负电不能聚焦 丙酮沉淀；将含 SDS的蛋白溶于含两性或非离子去污剂如 CHAPS ， Triton X100，NP-40等的缓冲液中并使SDS终浓度＜0.25%
2 最大限度减少样品的损失
低温保存样品(一般需低于-86℃) 尽量缩短处理时间 除盐，省略不必要的过程 保证样品在聚焦时不发生蛋白的聚集和沉淀。
样品制备流程及注意事项
预处理
(清洗等)
破碎
富集
按溶解度分级
溶解
除杂
样品的破碎

原则－最小限度的减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解


样品的来源

去除原则
– – – –
杂质的主要种类
DNA/RNA 脂质 多糖盐 离子去污剂
– 其他固体杂质
DNA/RNA的去除

样品中含核酸的不利影响
– 能被银染色法染色 – 在凝胶酸性部分产生水平条纹
– 当样品到达IEF凝胶酸性端时，与蛋白质一同沉淀

去除方法
蛋白沉淀法 DNase/RNase处理 超声(机械破坏)、超高速离心 DNA/RNA抽提(苯酚/氯仿)

固体杂质
阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦 过滤
样品的溶解

2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一
溶解的目标
样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个
多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使 2-DE中出 现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）

溶解方法必须允许可能干扰 2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物
对膜进行封闭 降低抗体与膜的非特异性结合

膜泡于封闭液中，4摄氏度摇晃过夜
抗原抗体杂交

一抗稀释后加于膜上，室温 1 到2 小时。洗去一抗后，加入生物素 连接的二抗，室温1小时。洗去二抗后，加Avidin-HRP反应。 洗去游离HRP后，立即用ECL化学发光剂进行检测。 HRP在碱性条件下催化发光胺氧化，放出光子 方法之一



应用

检测结核抗体 检测过敏原

蛋白质双向电泳技术