DNA甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。

随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。

这些方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。

近15年来，人们越来越认识到DNA甲基化研究的重要性，开发出一系列检测DNA的方法。

根据研究目的这些方法分为：基因组整体水平的甲基化检测，特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。

根据研究所用处理方法不同可以分为：基于PCR的甲基化分析方法；基于限制性内切酶的甲基化分析方法；基于重亚硫酸盐的甲基化分析方法和柱层法等。

DNA甲基化的分析方法很多，可分为总基因组甲基化的检测和单基因序列特异性甲基化分析的研究。

总基因组甲基化的检测又分为全基因组序列特异性甲基化分析和基因组非特异性甲基化水平的研究。

前者包括甲基化差异性杂交显示(differential methylation hybridization，DMH)、寡核苷酸微阵列法和基因组限制性酶切扫描法(restriction landmarkgenomescanning，RLGS)；后者包括3H—SAM掺人后液闪检测法和高压液相色谱法。

对单基因序列特异性甲基化分析包括传统的甲基化敏感的限制性内切酶(methylation sensitive restriction endonucleases，MSREs)分析、比较简洁的甲基化特异性PCR(methylation specific PCR，MSP)、全面反映甲基化情况的亚硫酸氢钠变性后测序(bisulfitegenomic sequencing)、甲基化敏感性单核苷酸引物扩增(methylation sensitive single nucleotide primer extension，Ms—SnuPE)、较新颖的甲基化荧光检测(methylight)、结合亚硫酸氢钠变性的限制性酶分析(combined bisulfite restrictionan alysis，COBRA)、酶的区域性甲基化特异性分析(enzymatic regional methylation assay，ERMA)和变性高压液相色谱法(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)。

甲基化敏感的单核苷酸的扩增(Ms—SnuPE)Ms—SnuPE即甲基化特异的单核苷酸扩增，它能对不同甲基化特异位点进行快速定量，是一种快速估计特异性CpG位点甲基化不同情况的定量方法。

先用重亚硫酸盐处理基因组DNA，未甲基化的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。

进行PCR扩增，然后取等量扩增产物置于2管中，分别作为Ms—SnuPE单核苷酸引物延伸的模板。

设计用于Ms—SnuPE延伸的引物的3’端紧邻待测碱基。

同时于2个反应体系中加入等量的Taq酶、引物、同位素标记的dCTP或dTTP。

这样，如果待测位点被甲基化，则同位素标记的dCTP会在反应延伸时连于引物末端；若是未被甲基化，则标记的dTTP参与反应。

末端延伸产物经电泳分离和放射活性测定后可得出C／T值，即为甲基化与非甲基化的比值，从而分析得到待测片段中CpG位点甲基化情况。

甲基化敏感限制性内切酶(MSRE)法methylation sensitive restriction endonuclease，MSRE是一类对其识别位点含有甲基化碱基敏感的限制性内切酶，目前至少已发现320种。

此类酶如在其切割位点中含有一个甲基化碱基，则它们中的绝大多数就不能切割DNA。

MSRE法是基于甲基化敏感Ⅱ型限制性内切酶不能切割含有一个或多个甲基化切点序列的基本原理。

用甲基敏感Ⅱ型内切酶及其同工酶(对甲基化不敏感)切割含有一个或多个甲基化CpG序列的片段，然后用DNA印迹法分析。

此法的最大优点就是无须知道靶DNA一级结构的详细信息，并可提供CpG岛甲基化状态的直接评价，包括取得一些对被检基因甲基化的定量分析信息。

但该法除了需要大量的高相对分子质量DNA(≥5ug)外，还只能检测到拷贝数比例大于百分之几的甲基化等位基因，并且仅能提供MSRE识别序列中那些CpG岛甲基化状态的信息。

甲基化荧光PCR检测甲基化荧光检测(methylight)是利用荧光定量性PCR检测亚硫酸氢钠处理后的序列改变。

在TaqManR技术中，可以使用3种不同的单核苷酸(正义引物、反义引物和荧光杂交探针)，进行不同序列的检测。

与已存在的技术相比，甲基化荧光检测最明显的优点就是能同时对几百甚至几千例样品迅速检测。

高敏感、快速是本方法最显著的特点，它可以在非甲基化等位基因超出10 000倍的情况下精确地检测到甲基化的等位基因并定量，而且可以做多样本、多基因位点的快速分析。

此外，该方法具备可重复、所需样本量少、不需要电泳分离的特点，可以为临床标本的分子生物学研究提供可靠的技术支持。

缺点是费用高，测定每个位点都要用两端标有荧光素的探针和一对引物，且受较多因素影响。

结合亚硫酸氢钠处理和酶解分析(COBRA)亚硫酸氢钠处理的DNA扩增后使甲基化的胞嘧啶残基成为胸腺嘧啶，而已经甲基化的胞嘧啶残基仍维持胞嘧啶。

这种变化会产生新的酶切位点或保持原有的甲基化依赖位点。

PCR 反应的引物中不包含CpG二核苷酸，因此与模板和原来的甲基化位点不会混淆。

在此之后，将PCR产物纯化、酶切、聚丙烯酰胺凝胶电泳、电印迹、单核苷酸杂交和磷图像定量。

COBRA是一个测定DNA甲基化敏感的定量方法，在检测完全甲基化和完全不甲基化的样品时最常用。

在甲基化变异细胞占少数的混杂的样品中，由于所用链特异性PCR不是特异扩增变异靶序列，故灵敏度较MSP差。

酶的区域性甲基化特异性分析(ERMA)酶的区域性甲基化分析是一种定量区域性CpG甲基化密度研究方法。

基因组DNA在亚硫酸氢钠处理后，感兴趣的区域由包含dam位点的引物扩增。

扩增后的PCR产物与14C标记的SAM及dam甲基转移酶温育，作为标准DNA定量的内参照。

之后将3H标记的SAM和M．SssI甲基转移酶温育。

在每个检测中使用具有确定甲基化位点细胞系DNA的标准混合物，每个样品的3H／14C比值转化为所测序列的甲基化密度百分比。

该方法不能确定单独CpG位点的甲基化状况。

亚硫酸氢钠测序法(bisulfite genomic sequencing)直接测序法是建立在MSP基础上进一步深入研究CpG岛各个位点甲基化情况的方法。

重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲基化因素的影响)所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。

最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。

此方法一种可靠性及精确度很高的方法，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态。

在寻找有意义的关键性CpG位点上，有其他方法无法比拟的优点。

测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序列为引物配对区，所以能够同时扩增出甲基化和非甲基化靶序列。

它的不足是耗费时间和耗资过多，至少要测序102.1 基因组整体水平甲基化分析2.1.1 高效液相色谱柱（HPLC）及相关方法HPLC是一种比较传统的方法，能够定量测定基因组整体水平DNA甲基化水平。

它由Kuo 等1980年[18]首次报道。

过程是将DNA样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，用紫外光测定吸收峰值及其量，计算5mC/(5mC 5C)的积分面积就得到基因组整体的甲基化水平。

这是一种检测DNA甲基化的标准方法。

但它需要较精密的仪器。

Fraga等2002年[19]运用高效毛细管电泳法(HPCE)处理DNA水解产物，以确定5mC的水平。

与HPLC相比，HPCE更加简便、快速、经济。

HPLC及HPCE测定基因组整体DNA甲基化水平的敏感性均较高。

Oefner等1992年[20]提出变性高效液相色谱法（DHPLC）用于分析单核苷酸和DNA分子。

邓大君等2001[21]将其改进与PCR联用建立了一种检测甲基化程度的DHPLC分析方法。

将重亚硫酸盐处理后的产物进行差异性扩增，由于原甲基化的在重亚硫酸盐处理时仍被保留为胞嘧啶，因此原甲基化的在PCR扩增时，其变性温度也相应上升，使PCR产物在色谱柱中保留的时间明显延长，这样就可以测定出PCR产物中甲基化的情况。

这种方法的最明显优点是：可用于高通量混合样本检测，能够明确显示目的片段中所有CpG 位点甲基化的情况，但不能对甲基化的CpG位点进行定位。

2.1.2 SssI 甲基转移酶法[22]SssI甲基转移酶能够催化DNA的CpG位点发生甲基化。

3H-S-腺苷甲硫氨酸(3H-SAM)在SssI甲基转移酶催化作用使基因组DNA的CpG位点发生甲基化。

通过测定剩余的放射性标记的SAM即可得到原基因组整体甲基化水平，即测到的放射性强度与所测DNA甲基化水平成反比。

这种方法的缺点是所使用的SssI甲基转移酶不稳定，致结果不够精确。

2.1.3 免疫化学法[23]这种方法是基于单克隆抗体能够与5mC发生特异性反应。

应用荧光素标记抗体使之与预先已固定在DEAE膜上的样品DNA特异性结合，对DEAE膜上的荧光素进行扫描得到5mC 的水平，其荧光素强度与5mC水平成正比。

Oakeley等1997年[23]报道了这种方法。

这种方法需要精密的仪器。

2.1.4 氯乙醛法Oakeley等1999年[24]首先描述了这种使用氯乙醛和荧光标记的方法。

首先，将DNA经重亚硫酸盐处理使未甲基化的胞嘧啶全部转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变（Frommer等1992年）[25]，然后经过银或色谱柱去除DNA链上的嘌呤，再将样品与氯乙醛共同孵育，这样5mC就转变为带有强荧光的乙烯胞嘧啶，荧光的强度与原5mC的水平成正比。

这种方法可以直接测定基因组整体5mC水平。

其优点是所用试剂价格低廉且稳定性好，避免了放射性污染，但缺点是费时费力，而且氯乙醛是一种有毒的物质。

2.2 特异性位点的DNA甲基化的检测2.2.1 甲基化敏感性限制性内切酶（methylation-sensitive restriction Endonuclease，MS-RE）-PCR/Southern法这种方法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区的不切割的特性，将DNA消化为不同大小的片段后再进行分析。

常使用的甲基化敏感的限制性内切酶有HpaⅡ-MspⅠ(识别序列CCGG)和SmaⅠ-Xmal(CCCGGG)等。