记Met和Leu等
利用放射性标记技术研究生物大分子 在细胞内的合成动态
步骤
– 适宜的放射性前体分子标记机体或细胞 – 常规制片 – 暗室敷乳胶(核子乳胶3-10m) – 暗盒暴光或自显影 – 显影、定影、观察
与显微自显影区别
敷胶要单层晶体 暴光时间长
定量细胞化学分析技术
细胞显微分光光度术(Microspectrophotometry) 利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收， 测定这些物质(如核酸与蛋白质等)在细胞 内的含量 包括： 紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法 BACK
0.2 m
电子显微镜技术(Electro microscopy)
0.2nm
扫描探针显微镜(Scanning Probe Microscope)
3nm, 0.7nm
扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope)
（侧0.1-0.2，纵0.001nm）
BACK
光学显微镜技术
自发荧光(叶绿素)、诱发荧光(酸性品红、甲基 绿、吖啶橙)
优点：
– 多种成分定位 – 只有激发荧光可成像，敏感度高 – 染色简便 – 标本呈彩色图像 – 固定细胞和活细胞
数字成像显微技术
图像后期处理，提高信/噪比、放大信号 摄像机和计算机 原理：摄取同一区域多幅图像，信号经
计算机放大、假信号减弱或消除
BACK
扫描遂道显微镜原理
量子力学中的隧道效应，即在低电压下，二电 极之间具很大阻抗，阻止电流通过(势叠)
当二电极间近到一定距离时，电极间产生了电 流(隧道电流)，且Iexp(-2Kd)，d为针尖与样品 间距离，K为常数，d转化为I的函数而被测定
扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产 生彼此间相互作用力，并在计算机显示出来，从 而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等
第二节 细胞组分的分析方法
离心分离技术 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异核酸的定位与定性 放射自显影技术 定量细胞化学分析技术
用超速离心技术分离细胞器与 生物大分子及其复合物
差速离心(differential centrifugation) 沉降系数S与大小和形状有关 密度梯度离心
BACK
细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂 质等的显示方法
DNA：Feulgen反应，酸除去RNA和DNA上的 嘌呤脱氧核苷酸，使其醛基暴露，自由醛基再 通过Schiff试剂反应呈紫红色
多糖：PAS反应，同上原理使希夫试剂与醛基 反应，但多糖先被过碘酸氧化
脂肪：四氧化锇，苏丹III，苏丹黑 蛋白质：Millon反应，氮汞试剂与蛋白质侧链
电镜三维重构技术与X射线晶体及核磁共振技 术，当前结构生物学主要实验手段
扫描电镜Scanning electron microscope
电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次 电子，探测器收集、转换、放大二次电子成 象
CO 2临界点干燥法，解决引起样品变形的表 面张力问题
景深长，具强烈立体感
不能观察活样品和细胞全貌
分辨率：1.5 nm 磷钨酸或醋酸双氧铀 机理：未知
Examples of negtively stained and metalshadowed specimens.
Electron micrographs of a tobacco rattle virus after negtive staining with potassium phosphotungstate(a) or shadow casting with chromium(b).
扫描遂道显微镜
特点 (1)对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，具高分辨(侧分 辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率达0.01nm) (2) 得到三维图象，可测量厚度信息 (3)可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性 (4)可连续成像，进行动态观察
用途 DNA、RNA、蛋白质、病毒等生物大分子结构；纳米生物 学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的 结构
荧光显微镜技术(Fluorescence Microscopy)
原理与应用
直接荧光标记技术 间接免疫荧光标记技术 在光镜水平用于特异蛋白质
等生物大分子的定性定位
如绿色荧光蛋白(GFP)的应用
荧光显微镜技术(Fluorescence Microscopy)
原理：以紫外线为光源，照射被检测物体发出 荧光后，在显微镜下观察其形状及位置仪器
冷冻断裂(fracturing)和冷冻蚀刻(etching)电镜 技术
原理：快速低温冷冻使样品从结构相对“脆弱” 部位 (磷脂双分子层疏水端)断裂，显示镶嵌在 脂膜中的蛋白质颗粒，冰在真空升华，可增强 “浮雕”式蚀刻效果
膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面，富立体感， 不需包埋，固定，很好保持真实性
冷冻深度蚀刻技术(quick freeze deep etching)： 细胞骨架纤维及结合蛋白
固定：OsO4、戊二醛、KMnO4、高频微波(低 温、快速、样块不宜太大)
包埋：完整、耐干燥、电子轰击和真空挥发， 环氧树脂(包埋剂要求)
切片 染色：锇酸染脂肪，铅盐染蛋白质，醋酸铀
染核酸
负染色技术negative staining
生物大分子(病毒、线粒体基粒、 核糖体、蛋白纤维)精细结构
暗场显微技术
明视野局限性
– 具颜色，吸收或折射随机光
暗场
– 通过样品进入成像系统的仅折射光或衍射光 – 微生物计数 – 放射自显影的银颗粒观察 – 分辨率低
激光共焦扫描显微镜技术 (Laser Scanning Confocal Microscopy)
原理：排除焦平面以外光的干扰，增强
图像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，可重构 样品的三维结构
第三章 细胞生物学研究方法
概论
细胞形态结构的观察方法 细胞组分的分析方法 细胞培养、细胞工程与显微操作技术
概论
对实验技术的依赖性 显微镜细胞学，奠基性作用 电镜与生物化学及分子生物学结合
细胞生物学，决定性作用
BACK
第一节 细胞形态结构的观察方法
光学显微镜技术(light microscopy）
（400-700）
成明暗反差和颜色变化
100nm 紫外光 玻璃透镜 不要求真空 （约200nm)
TEM
0.1nm
电子束 电磁透镜 （0.01-0.9）
要求真空
1.33x10-5～ 1.33x10-3Pa
利用样品对电子的散射 和透射形成明暗反差
超薄切片技术Ultrathin section
制样要求：样品很薄；完好保持其精细结构， 40-50 nm，即d为20 m细胞可切几百片，需 刚性、韧性
分子水平的原位杂交技术
(PCR技术)
BACK
利用放射性标记技术研究生物大分子 在细胞内的合成动态
放射自显影技术：利用放射性同位素电离 辐射对乳胶的感光作用，对细胞内生物大 分子进行定性定位与半定量研究的技术
追踪 DNA：3H-TdR RNA： 3H-U 蛋白质：35S 标记Met和 Cys，3H 或14C标
扫描隧道显微镜 Scanning tunneling microscope
1981年，IBM苏黎世实验室的Binnig，Rohrer， Gerber和Weible发明的，探测微观世界物质表面 形貌的仪器
统称扫描探针显微镜(Scanning Probe Microscope, SPM):包括STM、AFM (atomic force microscope)、 磁力显微镜、摩擦力显微镜等
定量细胞化学分析技术
流式细胞仪(Flow Cytometry)
分散群体细胞对待测成分染色悬液通过细胞仪
主要应用： 定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量 测定细胞群体中不同时相细胞的数量 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞 分离DNA含量不同的中期染色体
第三节 细胞培养、细胞工程与显 微操作技术
重标记、超薄切片、装配成分
应用：分泌蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的 定位与骨架蛋白的定位等
细胞内特异核酸的定位与定性
光镜水平的原位杂交技术
in situ hybridization
（同位素标记或荧光素标记的探针）
电镜水平的原位杂交技术
（生物素标记的探针与抗生物抗体相连的胶体金标记结合）
细胞培养
– 动物细胞培养 – 植物细胞培养 – 非细胞体系在细胞生物学研究中的作用
电镜三维重构技术
电子显微镜技术、电子衍射与计算机图像处理 相结合，适于难形成三维晶体膜蛋白、病毒和 蛋白质-核酸复合物三维结构
A.Klug 技术，一系列电镜照片经傅里叶变换得 到大分子电子密度图
低温电镜技术(cryoelectron microscopy)：直接 冰膜包埋，在-160°C制样台利用相位衬度成 像
活细胞，细胞核或线粒体动态
微分干涉(differential-interference)显微镜技术
原理
平面偏振光经棱镜折射分成两束，不同时 间经过样品的相邻部位，再经另一棱镜汇合， 使样品厚度的微小差别转换成明暗区别
优点 增加样品反差和立体感 可观察活细胞中较大细胞器 与录象机连接，活细胞中颗粒及细胞器运动 用计算机辅助，更精细结构
酪氨酸残基反应，成红色沉淀；重氮反应中， 氢氧化重氮与Tyr，Ser和His反应成有色复合物
BACK
特异蛋白抗原的定位与定性
免疫荧光技术 免疫酶标记技术 蛋白电泳(SDS-PAGE)与免疫印
迹反应(Western-Blot) 免疫电镜技术
特异蛋白质抗原的定位与定性
20th70年代，免疫学兴起，为特异蛋白的定性 定位提供了极重要手段
激光共焦点扫描显微镜