一、章（节、目）授课计划第页GAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAF二、课时教学内容第页GAGGAGAGGAFFFFAFAF技术的进步在一门学科的建立与发展过程中起着巨大的作用。

没有显微镜的发明就没有细胞的发现，更不会有细胞学说的建立，没有电子显微技术及其分子生物学技术的结合，就不会有细胞生物学今天的发展。

细胞生物学研究方法：一般来说，凡是用来解决细胞生物学问题所采用的方法，都属于细胞生物学研究方法。

当前细胞生物学研究中常用到的方法有:核酸和蛋白质成分的分析和序列测定、研究特异DNA、RNA常用的southern 杂交、Northwre杂交及蛋白质免疫印迹技术、基因打靶技术等等。

第一节细胞形态结构的观察方法一、有关显微镜的一些概念（1）分辨率（resolution）：指分辨物体最小间隔的能力。

光学显微镜的分辨率 R=0.61λ/N．sin（α/2）．其中λ为入射光线波长；N =介质折射率；空气中N =1GAGGAGAGGAFFFFAFAFα=物镜镜口角（样品对物镜镜口的张角）。

（2）放大倍数（magnification）：是指眼睛看到像的大小与对应标本大小的比值。

它指的是长度的比值而不是面积的比值。

例：放大倍数为100×，指的是长度是1μm的标本，放大后像的长度是100μm，要是以面积计算，则放大了10,000倍。

显微镜的总放大倍数等于物镜和目镜放大倍数的乘积。

（3）有效放大倍数（effective magnification）：物镜的数值孔径（NA）决定了显微镜有效放大倍数。

有效放大倍数，就是人眼能够分辨的d′与物镜的d间的比值，即不使人眼看到假像的最小放大倍数：GAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAF显微镜。

这两类显微镜又可根据不同的情况分成若干类型。

三、光学显微镜技术光学显微镜技术至今仍是细胞生物学研究的重要手段。

（一）普通复式光学显微镜技术1. 构成：①照明系统：光源、折光镜、聚光镜GAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAF教学内容小结（二）相差和微分干涉显微镜技术光线在通过密度不同的介质时，其滞留程度不同，即产生了光程差和相位差。

相差显微镜的基本原理把光程差变成振幅差(即明暗)。

从而提高样品反差，提高了各种结构GAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAF分辨力0.2nm，放大倍数可达106；用于观察超微结构（小于0.2µm）。

（二）主要电镜制备技术1、超薄切片技术用于电镜观察的样本制备。

通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度20-50nm。

由于电子束的穿透能力有限，为获得高分辨率的图像，切片厚度一般仅为40-50nm，即一个直径为20um的细胞可以切成几百片，故称超薄切片。

这需要样品具备一定的刚性和韧性，而生物样品不具备这些特性，因此需要包埋于特殊的介质中，包埋时会破坏样品的结构，因此在包埋前必须先将样品固定。

（1）固定：保持样品的真实性，细胞内部结构和成分保持在原来位置上通常以锇酸和戊二醛固定样品，低温，防止酶的自溶而破坏样品结构。

GAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAF主要特点：►具有原子尺度的高分辨本领：侧分辨率0.1-0.2nm，纵分辩率0.001nm►真空、大气、液体条件下工作►非破坏性测量局限性：►扫描隧道显微镜(STM)所观察的样品必须具有一定程度的导电性，对于半导体，观测的效果就差于导体；对于绝缘体则根本无法直接观察。

►在扫描隧道显微镜(STM)的恒电流工作模式下，有时它对样品表面微粒之间的某些沟槽不能够准确探测，与此相关的分辨率较差。

第二节细胞组分的分析方法形态学观察和细胞成分的分析相结合是当代细胞生物学研究中长采用的试验方法。

一、细胞组分分离技术►是分离细胞器及各种大分子基本手段。

GAGGAGAGGAFFFFAFAF►转速10~25kr/min的离心机称为高速离心机。

►转速>25kr/min，离心力>89Kg者称为超速离心机。

超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500kg。

（一）差速离心 Differential centrifugation ►特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心。

GAGGAGAGGAFFFFAFAF►沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。

►可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。

（二）密度梯度离心►用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。

►类型：速度沉降、等密度沉降。

►常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。

►分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。

GAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAF2.等密度沉降 isopycnic sedimentation►用途：分离密度不等的颗粒。

►特点：介质密度高，陡度大，介质最高密度大于被分离组分的最大密度。

力场比速率沉降法大10~100倍，需要高速或超速离心。

►原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。

GAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAF2、Feulgen反应：醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。

用于显示糖和脱氧核糖核酸3、四氧化锇:与不饱和脂肪酸反应成黑色，脂肪滴4、Millon（米伦）反应：氮汞试剂与组织中的蛋白质侧链上的络氨酸残基反应，形成红色沉淀，（有色复合物）蛋白质5、联苯胺反应：过氧化酶分解H202。

产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。

6、脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。

7、茚三酮反应：显示蛋白质三、特异蛋白抗原的定位与定性细胞内蛋白质定位法：免疫荧光技术和免疫电镜技术蛋白质体外定性法：免疫印迹、放射免疫沉淀、蛋白质芯片和质谱分析（一）免疫荧光技术根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，并标上标记荧光素，对抗原进行定位测定的技术。

GAGGAGAGGAFFFFAFAF快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限。

（二）免疫电镜技术能有效提高样品的分辨率，在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位。

免疫铁蛋白技术免疫酶标技术免疫胶体金技术GAGGAGAGGAFFFFAFAF应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等四、细胞内特异核酸序列的定位和定性分子杂交技术：具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。

这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。

►原位杂交（in situ hybridization）。

用于检测染色体上的特殊DNA序列。

最初是使用放射性DNA探针，后来又发明了免疫探针法。

五、应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态►用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。

►原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，GAGGAGAGGAFFFFAFAF经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光，对细胞内生物大分子进行定性、定位和半定量研究的一种细胞化学技术。

►一般用14C和3H标记。

常用3H-TDR来显示DNA，用3H-UDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。

14C半衰期为5730年，3H为12.5年。

六、定量细胞化学分析技术1、流式细胞仪►用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。

►可定量地测定某一细胞中的DNA，RNA或某一特异蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量。

特别是它还可将某一特异染色的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来，以及将GAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAF（二）、植物细胞培养1.原生质体培养：培养脱壁后的细胞，特点：①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；②便于进行细胞融合，形成杂交细胞；③适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。

2.单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。

GAGGAGAGGAFFFFAFAF(三)、非细胞体系来源于细胞，而不具有完整的细胞结构，但包含了进行正常生物学反应所需的物质（如供能系统和酶反应体系等）组成的体系即为非细胞体系（cell-free system）。

用途：研究DNA复制、RNA转录、蛋白质合成、高尔基体的膜泡运输机制以及细胞核装配等。

二、细胞工程（一）细胞融合与细胞杂交技术通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交。

►同核融合细胞：基因型相同的细胞融合形成的杂交细胞。

►异核融合细胞：基因型不同的细胞融合形成的杂交细胞。

►自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。

►诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。

在自然界中细胞自发融合发生的机率很小，一般需要GAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAF2、化学法：主要包括盐类融合剂、聚乙二醇（PEG）、二甲亚砜（DMSO）、甘油-醋酸酯、油酸盐、脂质、Ca2+配合物等。

其中聚乙二醇法是较常用的化学融合方法。

其原理是PEG分子具有轻微的负极性，与具有正极性基团的物质形成氢键，在原生质体之间形成分子桥，使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合。

3、物理法：电融合法。

其原理是改变原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。