第三章 细胞生物学研究方法
Methodology of Cell Biology
Cells are (relatively) small and complex. How do we study them?
第三章 细胞生物学研究方法
第一节 显微技术 • 一、光学显微镜
• 二、电子显微镜
• 三、显微操作技术 第二节 细胞分离与细胞培养 第三节 细胞及其组分的分析方法 第四节 细胞生物学研究常用的模式生物
antibodies for immunocytochemistry
Immunofluorescence staining for Golgi (blue) actin (green) histones (red)
颜色†
吸收 光谱 (nm)
发射 光谱 (nm)
Alexa Fluor 蓝色 350 — 405 紫色 — 430 绿色 — 488 蓝绿色 — 500 绿色 — 514 绿色 — 532 绿色 — 546 黄色 — 555 黄绿色 — 568 橙色 — 594 橙红色 — 610 红色 — 633 红色 — 647 红色 — 660 红色 — 680 红色 — 700 红色 — 750 红色
4. 绿色荧光蛋白
Fluorescence microscopy exploits special molecules called fluorophores（荧光团）
Fluorescent dyes/fluorophores absorb light (energy) of a specific color (wavelength)
收特定波长的短波光线，并发射 出比原来吸收波长更长的光。
照明方式通常为落射式
1. 激发滤光片 2. 反光镜 3. 阻断滤光片
荧光显微镜观察绿色荧光蛋白
荧光的观察
1. 自发荧光
某些天然物质本身能发出荧光，如叶绿素
2. 荧光染料染色
非荧光性物质用荧光色素染色后，可产生荧光。
3. 免疫荧光技术
带荧光标记的抗体与标本中的抗原结合
焦平面
激光共聚焦扫描显微镜照片
蓝色为细胞核，绿色为微管
微管绿色 微丝红色 核蓝色 普通荧光显微镜照片
激光作扫描光源
扫描焦平面上样品，得样品切面像
载物台上下微调改变焦平面 得不同层次的切面图像（光学切片） 计算机图像三维重组获样品立体图像
"显微CT"
Confocal Microscopy is the only way to get a true Z-stack for 3-D reconstruction from light microscope
微分干涉显微镜
（differential-interference microscope） （厚度差转变为明暗差；增加样品反差，立体感强）
荧光显微镜
（fluorescence microscope）
激光共聚焦显微镜
（laser scanning confocal microscope）
（一）普通光学显微镜
Nomarski differential-interference -contrast microscopy
dark-field microscopy
（二）荧光显微镜 Fluorescence microscope
特点：光源为短波光； 有两个特殊的滤光片； 照明方式通常为落射式。
荧光分子在受到光照射后，可吸
（三）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM
用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描； 分辨力是普通光学显微镜的~2倍； 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成 立体图像。
laser confocal scanning microscope, LCSM
• 在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。
波长和振幅 发生变化
相位差 发生变化
振幅差
原理
环形光阑（annular
diaphragm）：位于光源与
聚光器之间。 相位板（ phase plate）： 物镜中加了涂有氟化镁的 相位板，可将直射光或衍
射光的相位推迟1/4λ。
• 用途：观察未经染色的标本
(荧光共振能量转移：FRET)
作为共振能量转移供体、受体对，荧光物质必须满 足以下条件： ①受体、供体的激发光要足够分得开； ②供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。
广泛应用于检测酶活性变化、膜蛋白研究、大分子相互作用等； 在活细胞生理条件下实时对细胞内蛋白质-蛋白质间相互作用进 行动态研究。
（三）微分干涉显微镜 Differential interference contrast microscope （DIC）
• 1952年Nomarski发明，利 用两组平面偏振光的干涉， 加强影像的明暗效果，能显 示结构的三维立体投影。标 本可略厚一点，折射率差别 更大，故影像的立体感更强。
DIC显微镜下的硅藻（伪彩色）
346
401 434 495 502 517 532 556 555 578 590 612 632 650 663 679 702 749
442
421 541 519 525 542 554 573 565 603 617 628 647 665 690 702 723 775
免疫
免疫
荧光染料
肝癌细胞 蓝色：细胞核 绿色：微丝 红色：高尔基体
Fluorescein荧光素
图示：鼠主动脉平滑肌细胞的 荧光染色
核:blue; 线粒体:green; 肌动蛋白:red
免疫荧光显微技术 （Immunofluorescence microscopy）
⑴原理: 荧光抗体与标本切片中组织或细胞的抗原进行反应， 在荧光显微镜下 可观察到明亮的特异荧光。 ⑵荧光素标记抗体的方法 ①直接法：荧光素直接和第一抗体偶联。 ②间接法：荧光素先和第二抗体(抗第一 抗体的抗体)偶 联，再与第一抗体作用。
第二个偏振装置，即检偏器
棱镜
bright-field microscopy
棱镜 偏振镜
DIC microscopy
厚度差转变为明暗差； 增加样品反差，立体感强
（四）暗视野显微镜 dark field microscope
• 聚光镜中央有挡光片，视野
背景是黑的，只允许被标本
衍射的光线进入物镜，物体 边缘是亮的。 • 可观察 4~200nm的微粒子， 分辨率比普通显微镜高50倍。
激光共聚焦扫描 显微镜光路图
共焦小孔
激光共聚焦扫描 显微镜光路图
Confocal microscopy is a special type of fluorescence microscopy
共焦小孔
a special type of fluorescence microscopy used for thick specimens
Confocal Microscopy is the only way to get a true Z-stack for 3-D reconstruction from light microscope
(fluoresces) green light
• DNA sequence can be fused to other genes and reintroduced in to cells
肝癌细胞 蓝色：细胞核 绿色：GFP-LC3（自噬体 的标记分子） 红色：高尔基体
药物处理后的 肝癌细胞
Fluorescent Resonance Energy Transfer
This is a gallery show of the total 35 optical sections （光学切片） taken from the whole length of the cell, top to bottom
Confocal Microscopy is the only way to get a true Z-stack for 3-D reconstruction from light microscope
phase-contrast microscopy
Nomarski differential-interference -contrast microscopy
dark-field microscopy
（二）相差显微镜
• 把透过标本的可见光的光程或相位差变成振幅差，从而提高了 各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。
肝癌细胞 蓝色：细胞核 绿色：高尔基体
药物处理后的 肝癌细胞
药物处理后的 肝癌细胞 蓝色：细胞核 绿色：微管 红色：高尔基体
绿色荧光蛋白 green fluorescent protein GFP
特点: 可在光镜水平，对特异蛋白质等生物大分子 进行定位及显示一些细胞超微结构 • A natural protein fluorophore expressed in jellyfish • Absorbs blue light and emits
Fluorescent dye 荧光染料
Antibodies
• Antibodies are composed of 2 heavy chains, 2 light chains • Bind with very high affinity to their target antigen • May be produced in mice, rabbits, goats, sheep, chickens etc
Absorbtion excites them into a high energy state. This energy is reemitted as light of a longer wavelength (less energy). The chemical properties of a dye determine its excitation and emission wavelengths. Many different dyes available.