__T__4____DNA连接酶和__E_·_c_o_l_i _DNA连接酶。 (4)反转录作用的模板是__m__R__N_A_，产物是__c_D_N__A_______。
若要在体外获得大量反转录产物，常采用__P_C__R___技术。
(5)基因工程中除质粒外，动_植___物__病__毒_和噬__菌__体__也可作为运载体。 (6)若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处 理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是_未__处__理__的__大__肠__杆_。菌吸收
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考点一 基因工程的原理及工具 [典例引领]
【典例】 (2012·课标，40)根据基因工程的有关知识，回答下 列问题。 (1)限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末 端类型有__平__末__端__和_黏__性__末__端_。 (2)质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下： AATT C……G G……CTTAA
分子杂交
抗原—抗体杂交 个体生物学水平
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深度思考 基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便 于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是— G↓GATCC—；限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。
请据图分析： 切割目的基因时宜选择限制酶Ⅰ还是限制酶Ⅱ切割质粒呢？ 请说明理由。
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解析 (1)基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的 基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细 胞、目的基因的检测与鉴定。(2)基因表达载体构建过程中， 需要用同种限制酶切割目的基因和载体，使它们产生相同的 黏性末端，再用DNA连接酶把这两个DNA片段连接起来。 (3)农杆菌转化法导入目的基因时，首先必须用Ca2＋处理土壤 农杆菌，使土壤农杆菌转变为感受态；然后将重组质粒和感 受态细胞在缓冲液中混合培养完成转化过程。
常用类型 来源 功能
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
E·coli DNA连接酶 大肠杆菌
连接黏性末端
T4 DNA连接酶 T4噬菌体
连接 黏性末端和平末端
结果
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 磷酸二酯键
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3.载体 化学本质： 双链环状DNA分子
(1)常用载体——质粒特点能 有 有自 一 特位我 个 殊点复 至 的制 多标个记基限因制酶切割 (2)其他载体：λ 噬菌体衍生物、 动植物病毒 等。
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提示 由题图及题干信息知，目的基因两侧分别含 —GGATCC—序列和－GATC－序列，若使用酶Ⅰ切割，只 能切断一侧，不能切断另一侧，若使用酶Ⅱ切割，则可同时 切断两侧，从而切出目的基因，同理，质粒中也含两种酶识 别位点，且两识别位点均位于标记基因部位。若使用酶Ⅱ切 割质粒，则可同时破坏两个标记基因，使用酶Ⅰ切割则可保 留Gene Ⅰ作标记基因，故切割目的基因应选择酶Ⅱ，切割 质粒应选择酶Ⅰ。
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解析 切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，被水 解的磷酸二酯键有4个；—CATG↓—和—G↓GATCC—序列 被限制酶切出的黏性末端碱基数相同，都为4个碱基；只要 切割出来的黏性末端的碱基序列相同，都可以被DNA连接酶 连接。 答案 B
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[跟进题组] (2014·山东文登三模，35)在培育转基因植物的研究中，卡那 霉素抗性基因(kan)常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性 基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。如图为获得抗虫 棉的技术流程。请据图回答。
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(4)含有重组质粒的土壤农杆菌侵染离体棉花叶片组织后， 将离体棉花叶片组织培养成再生植株要经过[C]________和 [E]________。如要确保再生植株中含有抗虫基因，可在C过 程的培养基中加入________。 (5)目的基因能否在棉花植株体内维持和表达其遗传特性的关 键是______________。 这需要通过检测才能知道，检测采用的方法是________。
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为使运载 体与目的 基因相连 ，含有目 的基因的 DNA除可 用
EcoR Ⅰ切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶 必须具有的特切点割是产_生__的__D__N_A__片__段__末__端__与__。
EcoRⅠ切割产生的相同
(3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即
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3.
将目的基 因导入受 体细胞
①植物：农杆菌转化法 、基因枪法、
法
—方法②动管物通：道
技术
花粉
③微生物：显感微受注态射细胞法
4.
目的基因 的检测与 鉴定
①利用 ②利用 —③利用
技术检测目的基因的有无 技术检测目的基因的转录
技术检测目的基因的翻译
④利用 DNA分子杂交 的鉴定检测重组性状的表达
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(1)基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的 获取、________、 将目的基因导入受体细胞、_________________。 (2)A过程需要的酶有________和________。 (3)要把重组质粒导入土壤农杆菌，首先必须用________处理 土 壤 农 杆 菌 ， 使 土 壤 农 杆 菌 转 变 为 ________ 态 ； 然 后 将 ________在缓冲液中混合培养完成转化过程。
外源DNA的能力极弱
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1．基因工程的基本原理和理论基础概括(如下图)
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2．限制酶选择的注意事项
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[跟进题组] 1．下列有关限制性核酸内切酶的叙述中正确的是( )
A．用限制性核酸内切酶切割一个DNA分子中部，获得 一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有2个 B．限制性核酸内切酶识别序列越短，则该序列在DNA 中出现的几率就越大 C．—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏 性末端碱基数不同 D．只有用相同的限制性核酸内切酶处理含目的基因的片 段和质粒，才能形成重组质粒
一、基因工程的基本工具 1．限制性核酸内切酶
(1)来源：主要从 原核 生物中分离纯化而来。 (2)作用：识别特定的 核苷酸序列 并切开相应两个核苷酸 之间的 磷酸二酯键 。 (3)结果：产生 黏性末端 或平末端。
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2．DNA连接酶 (1)作用：将限制酶切割下来的DNA片段 拼接成DNA分子 。 (2)类型