微生物实验报告——细菌鞭毛染色及活菌运动观察摘要
关键词
前言
实验目的
实验原理
A.细菌鞭毛染色法的基本原理
B.压滴法观察活菌运动的基本原理实验器材
实验内容
(一)压滴法观察活菌运动
(二)细菌鞭毛染色
实验结果
参考文献
报告编写人：张行润
生命科学学院生科四班
200900140177 细菌鞭毛染色及活菌运动观察
摘要
鞭毛是细菌的运动“器官”，细菌是否具有鞭毛，以及鞭毛着生的位置和数目是细茵的一项重要形态特征．细菌的鞭毛很纤细，其直径通常为0 . 01 ~0.02um ，所以，除了很少数能形成毛束（由许多根鞭毛构成）的细菌可以用相差显微镜直接观察到鞭毛束的存在外，一般细菌的鞭毛均不能用光学显微镜直接观察到，而只能用电子显微镜观察．要用普通光学显微镜观查细菌的鞭毛，必须用鞭毛染色法。
细菌形态学观察包括细菌染色标本检查法和不染色标本检查法。
压滴法属于最常用的不染色标本检查法，主要用于检查细菌的运动性。
关键词
鞭毛（flagellum）细菌（bacteria）鞭毛染色法（flagellum staining）
光学显微镜（Optical microscope）压滴法（Pressure drop method）
前言
细菌的鞭毛极细，直径一般为10—20nm，只有用电子显微镜才能观察。
但是由于设备限制，我们希望能够在普通的光学显微镜下就能够看见细菌鞭毛。
于是，便产生了鞭毛染色法。
1958年Rhodes根据Fontana的螺旋体改良镀银染色法，建立了一种细菌鞭毛镀银染色法。
试剂分为媒染剂和银染剂。
但是试剂的稳定性低，容易变质。
2002年谷海瀛发明了一种新的细菌鞭毛镀银染色法。
该法将媒染剂分为A、B两种。
A液为酸化FeCl3溶液，B液为15%单宁酸，含甲醛1 ml，用时A、B液等量混合，轻微加热，染片40s，再用银染液涂片加热至微冒蒸汽，染色10 s。
这种方法不仅染色效果好，而且解决了试剂稳定性差的问题，此种试剂常温下至少可保存1年。
通过鞭毛染色，可以观察到鞭毛形态、数量和鞭毛在菌体分布的位置，鞭毛数量和在菌体上的分布位置是鉴定细菌的重要依据之一，根据鞭毛的这些特征，可将有动力细菌分为单端极鞭毛菌、单端丛鞭毛菌、周鞭毛菌、侧鞭毛菌。
有了这种简易的鞭毛染色方法，对于我们的细菌研究来说就更加方便容易了。
一．实验目的
1、学习并掌握鞭毛染色法并了解鞭毛的形态特征
2、巩固显微镜操作技术及无菌操作技术
3、学习压滴法观察细菌运动性（活细胞）
二．实验原理
1.细菌鞭毛染色法的基本原理
简单染色法适用于一般的微生物菌体的染色，而某些微生物具有一些特殊结构，如鞭毛，对它们进行观察之前需要进行有针对性的染色。
鞭毛是细菌的纤细丝状的运动器。
鞭毛的有无、数量及着生方式也是细菌分类的重要指标。
鞭毛直径一般为10~30nm，只有用电镜才可以直接观察到。
若要用普通光学显微镜观察，必须使用鞭毛染色法。
首先用媒染剂处理，使媒染剂附着在鞭毛上使其加粗，然后用碱性复红（Gray 氏染色法）、碱性复品红（Leifson氏染色法）、硝酸银（West氏染色法）或结晶紫（Difco氏染色法）进行染色。
2.压滴法观察活菌运动的基本原理
鞭毛的功能相当于船的螺浆，在水中可以高速旋转从而推动菌体前行，因此水体环境才是鞭毛细菌自由驰骋的天地。
鞭毛的旋转速度是非常快的，每秒钟旋转两百到一千多转，比一般的电动机要快得多。
鞭毛的高速旋转是由其附着于菌体上的基体旋转带动的，基体实际上就是鞭毛的基部，它由一个中轴套上两个或四个环构成，镶嵌固定在细菌的体表（细胞膜和细胞壁）中，在科学家的眼中，基体简直就是一台精巧的纳米机械—分子马达，但这个马达并不是靠电流驱动，而是用伴随着细胞膜两侧质子梯度的消失产生的生物能量ATP来驱动，鞭毛马达还可以转向（从反时针旋转变为顺时针旋转）从而使菌体发生翻滚进而改变细菌的运动方向，事实上细菌在游动时也并不是单纯地一直朝前游，而是伴随着不时的随机翻滚转向，但从表观上看仍表现为细菌的前行。
细菌未染色时无色透明，在显微镜下主要靠细菌的折光率与周围环境的不同来进行观察。
若想观察的更加清晰，可以滴加稀释美兰等染液进行染色，注意不要染色过重，以免影响观察，有鞭毛的细菌运动活泼，且不同时向一个方向运动，而无鞭毛的细菌则呈不规则布朗运动。
这样便可以在光学显微镜下观察到细菌的运动。
三．实验器材
(一)菌种
枯草芽孢杆菌（周生鞭毛）1~2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，铜绿假单胞菌（端生鞭毛）1~2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物等
(二)溶液和试剂
稀释美兰溶液，质量分数为95%的乙醇——水溶液，蒸馏水，硝酸银染液A液和B液等(三)仪器和其它用品
酒精灯，载玻片，盖玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，小试管，烧杯，试管架，载玻片夹子，滴管和滤纸等
四．实验内容
A.压滴法观察活菌运动（实验步骤流程）：
详细步骤：
1)洗片
用自来水和去污粉将载玻片清洗干净，然后用蒸馏水冲洗
2)涂片
在载玻片的一端滴加一滴或半滴蒸馏水，采用无菌操作将所要观察的菌种移动到水滴中少许（稍显浑浊即可），涂片完成
3)滴加稀释美兰
将稀释美兰滴加到涂片上，滴加均匀，注意不要滴加过多，否则影响活菌运动的观察
4)加盖玻片
加盖玻片时首先使盖玻片的一端接触载玻片上的液滴的一端，然后再将另一端缓缓放下，目的是防止气泡的产生，以免影响观察
5)迅速镜检（暗光）
由于菌体是放在蒸馏水中的，而且滴加的稀释美兰对其也有一定的影响，所以装片做好后要迅速镜检，以取得最佳的观察效果
B.细菌鞭毛染色
实验步骤流程：
详细步骤：
a)洗片
用自来水和去污粉将载玻片清洗干净，然后用蒸馏水冲洗
b)95%乙醇溶液浸泡
将洗好的载玻片放入盛有95%乙醇——水溶液的培养皿中，浸泡3~5min后取出晾干，目的是将载玻片上的油污等洗掉
c)涂片
在载玻片的一端滴加一滴或半滴蒸馏水，采用无菌操作将所要观察的菌种移动到水滴中少许（稍显浑浊即可），将载玻片倾斜使液滴从载玻片的一端流到另一端，然后用吸水纸吸取多余的液滴，涂片完成
d)自然干燥
e)滴加硝酸银A液
向涂片上滴加适量的硝酸银A液，保持3~5分钟
f)水洗
将上一步中所滴加的硝酸银A液洗掉，注意防止将涂片中的菌种冲掉
g)硝酸银B液冲洗
用硝酸银B液冲洗涂片，覆盖45’左右，宜稍稍加热
h)水洗
i)自然干燥（室温下）
j)镜检
将做好的涂片放到显微镜下，由多到少观察两种菌，以方便找到鞭毛（注：枯草杆菌的菌体较大，为周生鞭毛，也可能会出现侧生鞭毛的现象，这是因为鞭毛断掉；铜绿假单胞菌菌体较小，为端生鞭毛）
五．实验结果与分析
1、实验照片
a)鞭毛染色
铜绿假单胞菌（背景为暗黄色，菌群为褐红色）枯草杆菌（背景为肉红色，菌群为暗红色）10×100 10×100
2．实验结果分析
通过本次鞭毛染色实验，我认识到，以下几个方面决定了鞭毛染色是否成功。
1．染色用玻片干净无油污是鞭毛染色成功的先决条件。
2．菌种的菌龄。
老龄的菌种的鞭毛极易脱落，因此染色后很难看见有鞭毛。
可以选择菌落边缘的幼龄菌落。
3．在盖玻片上接种的时候，只需要在水中轻轻地沾几下即可，不要用里过猛，更不能用接种环大幅涂开。
若动作太重太大，菌种的鞭毛就会被刮落。
4．银染剂的使用方式和时间很重要。
若时间过短或方式不当，就很难在媒染剂上着色，那么，我们也就没有办法在显微镜下观察到鞭毛了。
5．鞭毛染色的玻片最好是自然晾干。
加热后菌种易变形，鞭毛易脱落，影响观察。
参考文献
沈萍，陈向东. 微生物学实验. 4版. 北京：高等教育出版社，2007.
沈萍，陈向东.微生物学.第二版.北京:高等教育出版社，2006
顾冠彬，房红莹，徐培君. 细菌的五种鞭毛染色方法比较研究. 中国血液流变学杂志.2005,15(3):483~485。