l - DNA
尾部合成基因
CCCGCCGCTGGA 5’ 3’ COS
λ-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点
野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点， 不利于重组操作，必须删除至1 - 2个 同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增 加一些单一的酶切位点 除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增 加酶位点
Apr

HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI
lacZ’

pUC18
2.7 kb
ori
质粒DNA提取的策略

质粒DNA的提取
细菌细胞破碎----碱使染色体DNA变性-----离心分离------收集质粒DNA----纯化------保存


HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI
重组子：
lacZ’
2.7 kb + 4.0 kb
pUC18
2.7 kb
Apr ori
非重组子： 2.7 kb

DNA片段大小检测
1.0 kb 0.8 kb

全酶解图谱法：
4.0 kb

P
B

用EcoRI酶切转化子质粒DNA 目的重组子： 3.0 kb + 3.7 kb 或者： 1.0 kb + 5.7 kb 用PstI酶切转化子质粒DNA 目的重组子： 3.2 kb + 3.5 kb 或者： 0.8 kb + 5.9 kb

第二章
基因工程载体和工具酶
第一节 载体
载体的功能及特征
运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
克隆载体应具备的条件
具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） 具有与特定受体细胞相适应的复制位点整合位点 具有较高的外源DNA的装载能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有合适的筛选标记
质粒DNA沉淀

二倍体积的无水乙醇与DNA相混合。使乙醇的终含量占
67%左右。室温静置30分钟。

乙醇沉淀时，加NaAc or NaCl至终浓度为0· 1-0· 25M，是
为了中和DNA分子在碱性条件下所带的负电荷，减少DNA
分子同性电荷的相斥力。

0· 6倍体积的异丙醇沉淀，-20°C半小时。
DNA分离
YAC的构建
酵 母 人 工 染 色 体 的 应 用
克隆载体的发展历史：




第一代：环状质粒，装载几个到十几个kb片段; 第二代：经过改建的病毒，装载能力２０kb左右; 第三代：cosmid,装载能力30-40kb; 第四代: YAC, 装载能力1-2 Mb; 第 五代: 新型载体: BAC, PAC, MAC, Fosmid 等,装载能力 80-200kb

EB与DNA
DNA大小测量

凝胶上与标准分子量比较 λHindIII 100bp ladder 自己的marker
在紫外透射仪下看DNA时，DNA亮度与哪些因素有 关？

DNA浓度 DNA大小 波长 纯度 EB量等有关
DNA电泳结果分析
2. λ噬菌体

λ 噬菌体DNA 是线性双链DNA分子，48.5kb 噬菌体λ粒子，DNA线性双链，带有12bp的粘性末端，称为cos位点。 噬菌体感染细菌以后，双链DNA分子通过COS位点成环状
酵母人工染色体（YAC）
YAC载体应含有下列元件：
酵母染色体的端粒序列
TRP1
ARS1
CEN4
EcoRI
酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列 酵母系统的选择标记 大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的选择标记
ori TEL BamHI TEL Apr pYAC4 URA3
YAC载体的装载量为350 - 400 kb


在pBR322基础上改建，增加了一个多接头 （polylinker），即增加了多克隆位点。 全长 3.8 kb
Plasmid plink 322
pUC 质粒(University of California)

pUC 质粒 是由大肠杆菌 pBR322 质粒 而成的双链DNA质粒载体
与M13 噬菌体改建
第二章
基因工程载体和工 具酶
湖南师范大学生命科学学院 袁婺洲
本章目录

2.1 载体 2.1.1 质粒载体 2.1.2 噬菌体载体 2.1.3 其他载体 2.2 工具酶 2.2.1 限制性核酸内切酶 2.2.2 DNA聚合酶和Klenow大片段 2.2.3 DNA连接酶 2.2.4 碱性磷酸酶 2.2.5 末端脱氧核苷酸转移酶

(一)插入型载体
在Charon4 载体中克隆 外源DNA
3. M13单链噬菌体

M13噬菌体的生物学特性： 生物结构

M13噬菌体的外型呈丝状 M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成 M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长 M13 DNA全长6407个核苷酸 M13 DNA上至少有10个基因

1978年由Collins和 Hohn改建 正常的质粒与噬菌体的cos位点构成 有Amp，Tet 抗性基因 Cos位点可识别噬菌体的外壳蛋白，可被包装
柯斯质粒（cosmid）的结构
BamHI Tcr
SalI
Apr
PstI
1.8 kb的l-DNA片段 + pBR322片段 装载范围为31 - 45 kb
5.人工微小染色体

YAC, yeast artificial chromosome BAC, bacteria artificial chromosome PAC, P1 artificial chromosome MAC,mammal cell artificial chromosome Fosmid, F因子 改建 而来
空转化子是蓝色。
Plasmid pUC 18/pUC 19 结构
改建质粒的要求：

尽可能使质粒缩小，以便插入更大的外源DNA片段； 增加多种酶切位点； 增加标记基因； 提高外源DNA的表达水平； 增加质粒在受体细胞中的拷贝数
转化子的筛选方法

遗传标记筛选（载体与目的基因本身） DNA片段大小检测
真核细胞DNA的提取
研磨使细胞破碎-----蛋白酶K去核蛋白----分离蛋白质与DNA------纯化----沉淀------纯度检测
质粒DNA的纯化



RNA酶去RNA SDS-蛋白复合物 蛋白酶K去蛋白质 酚-氯仿抽提 纯化试剂盒 紫外分光光度计测A260与A280值：1· 8 或2· 0


核酸分子杂交
目的基因表达产物检测

pBR322 质 粒 克 隆 外 源 基 因 的 过 程
载体遗传标记检测

抗药性筛选法
将外源DNA片段插在EcoRI位点：

EcoR I Cla I Hind III Pst I BamH I Apr

非重组子呈 重组子呈
Apr、Tcr Apr、Tcr
Pvu I Pst I
2700个外壳蛋白分子
大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA

M13 DNA载体的构建：

III
VI
I
IV
II
X
V
VII
IX
野生型M13RF-DNA
VIII
III VI I IV II X V VII IX

M13mp系列载体
VIII
polylinker lacZ‘
DNA测序 片段的 扩增
4. 柯斯质粒cosmid

Tcr
pBR322
4363 bp
Sal I

将外源DNA片段插在BamHI位点：

ROI ROP
Bal I
非重组子呈 重组子呈
Apr、Tcr Apr、Tcs
ori
Hind II


载体遗传标记检测
显色筛选法
lacZ'

将外源基因克隆在pUC18的lacZ’标 记基因内部，使之灭活，此时重组
ori
Cl Br
O N N Cl Br
LacZ基因表 达的蓝白斑 菌落
基因工程质粒：Plasmid pBR322
松驰型质粒 Ampr， Tetr 多种限制性酶切位点 全长 4362 bp
Plasmid pBR322结构图
4363bp
pBR322质粒结构来源
Plasmid plink 322

Λ基因组三个区域：
左侧：包括外壳蛋白基因，20kb
中间区：18kb
右侧：复制及裂解基因，12kb
λDNA+外源DNA之和必须在39-53kb之间，所以可插入7-21kb的外源片段
λ噬菌体的基因组结构
溶菌控制基因 晚期控制基因 DNA合成控制基因 阻遏基因
cos
头部合成基因
早期控制基因
阻遏基因 重组基因 删除与整合基因 COS 3’ 5’ TCCAGCGGCGGGG

pUC 18/pUC 19 全长 2674 bp ，有 Amp 抗性基因，一个
复制起点ori。带有lac Z的N端 标记序列；因在复制起点
ori区域内缺失 rop 基因（改进的pMB1复制子），细胞即使
生长在无氯霉素环境中也可形成高拷贝数（500-700）。