植物转基因主要步骤
农杆菌转化法
反义RNA作用原理 5´ C A U G 3´ 3´ G U A C 5´
mRNA Antisense RNA
转入成熟酶antiRNA后, 西红柿保存期延长至1个月
二、转基因动物
• 转基因动物就是基因组中含有外源基因的动物。它是按照预先的设计，通 过细胞融合、细胞重组、遗传物质转移、染色体工程和基因工程技术将外 源基因导入精子、卵细胞或受精卵，再以生殖工程技术，有可能育成转基 因动物。 通过生长素基因、多产基因、促卵素基因、高泌乳量基因、瘦肉型基因、 角蛋白基因、抗寄生虫基因、抗病毒基因等基因转移，可能育成生长周期 短，产仔、生蛋多和泌乳量高，生产的肉类、皮毛品质与加工性能好，并 具有抗病性，已在牛、羊、猪、鸡、鱼等家养动物中取得一定成果。 还可将转基因动物作为生物工厂（Biofactories）, 如以转基因小鼠生产 凝血因子IX、组织型血纤维溶酶原激活因子（t-PA）、白细胞介素2、 α1-抗胰蛋白酶，以转基因绵羊生产人的α1-抗胰蛋白酶，以转基因山羊、 奶牛生产LAt-PA，以转基因猪生产人血红蛋白等，这些基因产品具有高 效、优质、廉价与相应的人体蛋白具有同样的生物活性，且多随乳汁分泌， 便于分离纯化。
• 由该技术衍生出一些新的技术，如 RAPD和AFLP等技术。
第二节 载
Байду номын сангаас
体
载体（vector）：体外重组DNA实验，将外源DNA片段运送进宿 主细胞进行扩增或表达的运载工具。也是一种DNA分子。
载体必须具备的4个条件：
1. 该载体必须具备适合的单一酶切位点， 且这些酶切位点不在复制原点区域内。 2. 该载体在细胞内必须能自主复制，即必 须具备复制原点； 3. 载体上要有选择标记，如抗生素基因； 4. 载体上要有插入外源DNA的克隆位点或插 入位点
标记（α –互补的显色表型）。
2、噬菌体
λ 噬菌体（温和型）： 基因组全长为49kb。能接受15kb外源 DNA片段作为cDNA或核DNA克隆载体。 优点： ♣不易引起生物危害，有助于“目的”基因 进入细胞并增殖；
♣携带大片段外源DNA分子，占总量25%时 仍不失活。
3、柯斯质粒(cosmid)：
•
• •
1996年，威尔穆特研究小组克隆羊“多莉”诞生（利用6岁成 年母羊乳腺细胞）。 1997年，威尔穆特小组报道用胎儿细胞为核供体，获得了表 达治疗人血友病的凝血因子IX转基因克隆羊“波莉”
• •
1998年，美国夏威夷大学用一只实验鼠的细 胞克隆了3代共50只实验鼠。 2000年，美国用无性繁殖技术克隆猴子“泰 特拉”，意味克隆人体已无技术障碍。
Sau 3A I 5’ ----GATC--- 3’ 3’ ----CTAG---- 5’
- 5’ ---G GATCC---3’ ----CCTAG G--- 5’ 5’ ---GATC--- 3’ 3’ ----CTAG ---- 5’
Bam H I、Sau 3A I、Mbo I、Nde Ⅱ一组同尾酶
EcoR I
Alu I
5’ ----AGCT--- 3’ 3’ ----TCGA---- 5’
5’ ----AG 3’ ----TC
CT--- 3’ GA---- 5’
平端切割
Hpa Ⅱ
5’----CCGG----3’ 3’----GGCC---- 5’
Msp I
同切酶
5’ ----GGATCC--- 3’ Bam H I 3’ ----CCTAGG---- 5’
1973年 科恩（Cohen S.）等进一步将酶切DNA分子与质粒DNA连接起 来，并将重组质粒转入E. cloi细胞中。 1982年，美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在细菌中生产人的 胰岛素投放市场。
• •
• • •
1985年，转基因植物获得成功。 1986年，穆勒斯发明了PCR技术，专利转让达3亿美元。 1990 年9月14日是基因治疗的诞生日。在美国马里兰州的一个医疗中心 进行第一例基因治疗临床试验。一个4岁的小女孩戴斯瓦(A.DeSilva)，患 有严重综合免疫缺失症（SCID）。将腺苷酸脱氨酶（ADA）基因转入骨 髓细胞，再送回病人体内，基因治疗SCID获得初步效果。 1994年，延熟保鲜的转基因番茄商品生产。
①. EcoR ②. Hind
I 来自大肠杆菌（Escherichia coli）； Ⅲ来自嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）。
二、连接DNA片断的酶
• 第1种：连接粘端的连接酶 （图A）
• •
第2种：连接平端DNA的连接酶。 T4 DNA连接酶（图B）
•
第3种：先加人工接头，形成粘端，再由DNA连接酶连接。
2. 重组DNA的发展：
• 1971年 史密斯（Smith H. O.）等人从细菌中分离出的一种限制性酶， 酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。
•
1972年 伯格（Berg P.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和λ 噬菌体 DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来得到新的DNA分子。完成了世 界上第一个体外重组DNA实验。
2.限制性核酸内切酶的类型
• • • 第Ⅰ类酶：有特定识别序列，切割部位无特异性
切割远离识别位点，甚至1000bp,随机切割。
第Ⅲ类酶：有特定识别序列，切割有特异性（在识别序列外，20bp）
切割可产生各种类型的单链末端。
第Ⅱ类酶：有特定识别序列，切割有特异性（在识别序列内）
识别序列有4、6、8个或更多核苷酸对。
中国转基因植物面积
• 转基因棉花已经大规模商品化生产。
•
转基因棉花、大豆、马铃薯、烟草、 玉米、花生、菠菜、 甜椒、小麦等 进行了田间试验，
•
2004年我国的转基因农作物和林木已 达27种。
3．重组DNA
重组DNA内容：
①从细胞和组织中分离DNA； ②限制性内切酶酶切DNA分子，制备DNA片段； ③将酶切DNA分子与载体DNA连接,构建重组DNA
首先，细菌细胞中发现限制-修饰系统（R-M）：
1）限制：降解外源DNA,防御异源遗传信息进入的手段(限制性内切酶)。 2）修饰：修饰外源DNA片段后,保留在新细胞中(甲基化酶)。
• • 限制性内切酶酶切方式：以交错方式切断 DNA双链，产生二个相同单链粘性末端。 重组过程：两种片段在适宜条件下，可经 磷酸二脂链，连接成重组DNA分子。
•
•
2001年，美国宣布首次克隆成功处于早期阶 段的人体胚胎。
2002年，12 月法国研究者宣布克隆出第一个 女婴，但一直未获得证实。
全世界转基因植物面积
1996年 170万公顷， 1997年1100万公顷， 1998年2780万公顷， 1999年3990万公顷， 2000年4420万公顷， 2001年5260万公顷， 2002年5000万公顷。
分子；
④把重组DNA分子引入宿主受体细胞,复制； ⑤重组DNA随宿主细胞的分裂而分配到子细胞, 建
立无性繁殖系(clone) ；
⑥从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系,并使外
源基因在受体细胞中正常表达,翻译成蛋白质等基 因产物、回收；或筛选出获得定向性状变异个体。
第一节 工具酶
作用 底物
1. 核酸酶：切割DNA分子中，两个相邻核苷酸之间的磷酸二脂键, 使之水解成多核苷酸片段。 2. 核糖核酸酶(RNase)：专一水解断裂RNA分子的两个相邻核苷酸 之间的磷酸二脂键。 3. 脱氧核糖核酸酶(DNase)：专一水解断裂DNA分子的两个相邻核 苷酸之间的磷酸二脂键。
3.限制性核酸内切酶的命名
• 限制性内切酶的命名：根据其来自的生物分类学上的属名、种 名和菌株名来命名。
酶名称的第一个字母是属名的第一个字母，大写，斜体。
第二、第三个字母是种名的前两个字母，小写，斜体。
第四个字母是菌株名的前两个字母，大写或小写，正体。 最后，罗马数字，表示分离几种酶的编号， I、 Ⅲ
Pst I
5’----CTGCAG----3’ 3’----GACGTC---- 5’
5’ ----GAATTC--- 3’ 3’ ----CTTAAG---- 5’
- 5’ ---CTGCA G---3’ ----G ACGTC--- 5’ - 5’ ---G AATTC---3’ ----CTTAA G--- 5’ 粘性末端
切割 方式 其它 酶类
1. 外切酶：从核苷酸的末端开始，逐个消化降解多核苷酸。 2. 内切酶：从核苷酸分子内部切割磷酸二脂键，而生成DNA片段。 1. DNA聚合酶： 2. RNA聚合酶： 3. 反转录酶
一、限制性内切核酸酶
1. 限制性内切酶(restriction enzyme)：从核苷酸分子内部切割磷酸 二脂键，而生成DNA片段。如：EcoR I、Hind III
三、DNA聚合酶
•
•
大肠杆菌，polⅠ、polⅡ、polⅢ 三种。
Taq DNA聚合酶 从栖热水生菌（75⁰C热泉）分离得到。用于PCR
PCR
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)
PCR反应三个步聚(一个循环)：
1. 变性：94~95℃使模板DNA双链 变成单链； 2. 复性：50~70℃下，引物分别与互 补DNA单链互补配对； 3. 延伸：在引物的引导和Taq酶作用 下，72 ℃下合成模板DNA的互补 链。 • PCR反应通常有25~35个循环，一般 可扩增5kb左右的片段。
常用的载体包括三大类，即质粒、噬菌体、噬粒
• • • • 质粒（常用的有pBR322、pUC系列） 单链丝状噬菌体 噬粒（常用的大肠杆菌丝状噬菌体包括M13噬菌体f噬菌体等） 人工染色体（噬菌体人工染色体PAC、细菌人工染色体BAC、酵 母人工染色体YAC ）
1、质粒 如pUC18质粒具有以下特点： ①. 分子量小,可接受较大外源片段； ②. 拷贝数多,500个／细胞； ③. 克隆位点的酶切位点多,克隆方便； ④. 具有用于检测重组质粒的选择