SOD(超氧化物歧化酶)活性测定
氮蓝四唑法
一、原理
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ，SOD)普遍存在动、植物的体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下面的反应：
o 2.-+H O 2
22+O H ＋
反应产物H 2O 2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。

超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性的大小。

在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易被氧化而产生超氧阴离子，超氧阴离子可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大吸收。

而SOD 可清除超氧阴离子，从而抑制了甲腙的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶的活性愈低，反之酶的活性俞高。

据此可计算出酶活性的大小。

二、材料、仪器设备及试剂
(一)材料
植物器官(花瓣、叶片等)
(二)仪器设备
冰箱、低温高速离心机、微量加样器 (1mL 、20μL 、100μL)、移液管、精密电子天平、UV-752型紫外分光光度计、试管、研钵、剪刀、镊子、荧光灯(反应试管处照度为4000Lux 或Lx)
(三)试剂
(1) 0.05mol/L 磷酸缓冲液(PH7.8)。

(2) 130mmol/L 甲硫氨酸(Met)溶液：称1.9399gMet 用磷酸缓冲液定溶至100mL 。

(3)750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定溶至100mL ，避光保存。

(4)100μmol/LEDTA -Na 2溶液：称取0.03721g EDTA-Na 2，用磷酸缓冲液定溶1000mL 。

(5)20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g 核黄素用蒸馏水定溶到1000mL ，避光保存。

三、试验步骤
(一)酶液的提取
(1)称取植物材料(去叶脉)0.2g ，加1ml 预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲
液使体积为5mL。

取2mL于1000r/min下离心20min，上清液即为SOD粗提液。

(二)显色反应
取5mL的试管(要求透明度好)若干，有对照、处理。

按下表加样：
试剂(酶) 用量/mL 终浓度/比色时
0.05mol/L磷酸缓冲液 1.5
130mmol/Lmet溶液0.3 13mmol/L
750μmol/LNBT溶液0.3 75μmol/L
100μmol/L EDTA-Na2液0.3 10μmol/L 20μmol/L核黄素0.3 2.0μmol/L 酶液0.05 对照液用缓冲液
蒸馏水0.25
总体积 3.0
混合后将一支对照管置暗处，其他各管于4000Lx日光下反应20min。

(三)SOD活性测定与计算
至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其他管的吸光度。

四、计算酶活力
已知SOD活力单位以抑制氮蓝四唑光还原的50%为一个酶活力单位表示，按下式计算SOD活性。

SOD总活力=[(A CK-A E)×V]/(0.5×A CK×W×V t)
SOD比活力= SOD总活力/蛋白质含量
公式中：SOD总活力以鲜重酶单位每克表示；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；
A CK为照光对照管的吸光值；A E为样品管的吸光度；V为样品液总体积，mL；V t为测定时样品用量，mL；W为样品鲜重，g；蛋白质含量单位为mg/g。