植物组织中超氧化物歧化酶和平测定方法
【实验目的】
1. 了解还原法测定抗氧化酶活性测定的原理方法。
2. 熟悉植物叶片中ROS 去除机制。
【实验原理】
超氧化物歧化酶（SOD ）普遍存在于动植物与微生物体内。
SOD 是含金属辅基的酶。
高等植物有两种类型的SOD ：Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD 。
SOD 能够清除超氧阴离子自由基 （O 2—），它与CAT 、POD 等酶协同作用来防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而减少自由基对机体的毒害。
超氧阴离子自由基（O 2—）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。
SOD 能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧阴离子自由基，生成H 2O 2和O 2。
生成的H 2O 2可被过氧化氢酶分解为O 2和H 2O ：
2 O 2—+ 2H + H 2O 2+O 2 2 H 2O 2 O 2+H 2O
超氧自由基非常不稳定，寿命极短，一般用间接方法测定SOD 活性。
本实验依据SOD 抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性的大小。
有氧化物质存在时，核黄素可在光照条件下还原。
被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O 2—。
当加入NBT 后，在光照条件下O 2—又可将NBT 还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大光吸收。
当加入SOD 时，SOD 可通过清除O 2—，而抑制NBT 的光还原反应，使蓝色甲腙生成速度减慢。
于是，进行光还原反应后，反应液蓝色越深，说明酶的活性越低，反之酶的活性越高。
抑制NBT 光还原的相对百分率与酶活性在一定范围内呈正相关关系，据此可以计算出酶活性的大小。
常常将抑制50%的NBT 光还原反应时所需的酶量作为一个酶活性单位（U ）。
【器材与试剂】 1. 实验仪器与用具
研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、微量移液枪、刻度移液管、离心管、光照箱（光照度为4000lx ）、容量瓶（10ml ）、试管
2. 实验试剂
50mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）； 130mmol/L 甲硫氨酸（MET ）溶液； 750μmol/L 氮蓝四唑（NBT ）溶液； 100μmol/L EDTA- Na 2溶液；
CAT
SOD
20μmol/L 核黄素溶液；
SOD 提取介质：50mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）内含1% PVP 。
3. 实验材料
正常生长或经逆境处理的小麦叶片 【实验步骤】
1. SOD 提取：称取植物材料0.5g 于预冷的研钵中，加入2ml 预冷的提取介质，在冰浴条件下研磨成匀浆，转移至10ml 容量瓶中，用提取介质冲洗研钵2～3次（每次1～2ml ），合并冲洗液于容量瓶中，定容至10 ml 。
取5ml 转入到离心管中，于4℃、10000 r/min 离心15min ，收集上清液，即为SOD 粗提液。
2．活性测定：取透明度好、质底相同的试管4支。
测定管2支，光下对照1支，暗中对照1支（调零）。
按下表所列内容加入各种溶液（注意最后加入核黄素溶液）。
表 测定SOD 活性时各试剂加入量
试剂/ml
测定管 光下对照
暗中对照
1
2 3 4 50mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8） 1.5 1.5 1.5 1.5 130mmol/L MET 溶液
0.3 0.3 0.3 0.3 750μmol/L 氮蓝四唑（NBT ）溶液 0.3 0.3 0.3 0.3 100μmol/L EDTA- Na 2溶液 0.3 0.3 0.3 0.3 20μmol/L 核黄素溶液 0.3 0.3 0.3 0.3 粗酶液 0.1 0.1 0 0 蒸馏水
0.5
0.5
0.6
0.6
4号试管加入核黄素后立即用黑布套遮光，全部试剂加完后摇匀，将试管置于4000 lx 荧光灯下显色反应15～20min （要求各管照光一致，反应温度控制在25～35摄氏度）。
反应结束后用黑布罩遮盖住试管终止反应。
以4号管作空白（调零），在560nm 下测定吸光度，记录测定数据。
3．结果计算
SOD 活性(U ·g -1FW ·h -1) =
t
V FW A V A A S t S ⨯⨯⨯⨯⨯⨯-5.060
)(00
式中，A0：光下对照管吸光度；A S ：样品测定管吸光度；Vt ：样品提取液总体积（ml ）；V S ：粗酶液量；t ：显色反应光照时间（min ）；FW ：样品鲜重（g ）。
【实验结果】 1. 测定数据记录
1（逆境测定管）
2（CK 测定管）
3（光下对照管）
4（暗中对照管）
吸光度A 0.076
0.087
0.437
0.000
反应时间
20 min
2. 计算
逆境下：SOD 活性=
20
1.05.05.0437.060
10)076.0437.0(⨯⨯⨯⨯⨯⨯-=991.3 U ·g -1FW ·h -1
正常环境下：SOD 活性=20
1.05.05.0437.060
10)087.0437.0(⨯⨯⨯⨯⨯⨯-=961 U ·g -1FW ·h -1
可以看出，逆境下的SOD 活性升高。
【注意事项】
1．线粒体内SOD 酶浓度较高，因此研磨要充分。
2．要求各管受光情况一致，所有反应管应排列在与日光灯管平行的直线上。
反应温度控制在25℃，视酶活性高低适当调整反应时间。
温度较高时，光照时间应缩短；温度较低时，光照时间相应延长。