阳离子脂质体 ! 鱼精蛋白 " # $ 复合物与脂质 ! % ! " # $ 复合物体外细胞转染率比较
孙 逊& 田 聆’ 聂
( 宇 & 张志荣 & 路
娇 & 魏于全 ’
+ & , , & . + & , , & .
四川大学 华西药学院 靶向药物与新型给药系统实验室 * 成都 & ) 四川大学 华西医院 人类疾病生物治疗教育部重点实验室 * 成都 ’ ) 摘要
基 因 治 疗 为 一 些 长 期 困 扰 人 类 的 重 大 疾 病* 如 恶性肿瘤 G 遗传病 G 感染性疾病的有效预防和治疗带 来了希望 J 伴随着基因治疗而出现的基因载体研究 *
% 国 家 高 技 术 研 究 发 展 计 划 ) B + C 计 划 .资 助 项 目 ) ’ , , C & D , & & . 22’ / E F8 9 9 ( 通讯作者 J 5 1; 4 8 C 0 C C 8 4 5 @ 4 = ; : 7 1
生 物 医 学 工 程 学 杂 志
第, .卷
$ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ 脂质与细胞融合后 ! 重组基因导入细胞 ! 脂质体即被 磷脂可被细胞生物膜利用 " 目前 ! 已有不少基 降解 ! 因治疗的脂质体制剂进入临床试验 " 脂 质# 聚 阳离 子 # 是近年来 * ! $ %& 复合物 ’ ( ) $ 在 阳 离 子 脂 质 体# 发展起来 $ %& 复 合 物 的 基 础 上 ! " 与 阳 离 子 脂 质 体# 因而 $ %& 复合物相比 ! ( ) $ 能更有效地缩合 $ %&! 其可能提高对细胞的转染率 " 这方面的研究国外报
2 材料与方法
2 3 4 仪器与试剂 # < 3 = . *质 粒 @ @ # 5 67 1 8 9 : ;’ > ? ( A 5 B C D : E 9 FA G D H 分析试 剂盒 美 国 公 司 鱼 精 蛋 白 硫 ’ * 0 I 9 8 J G K A K B I D G 酸 盐@ 二甲基双十八烷基溴化铵 ’ 二 油酰 磷 * @ $ $ &L 脂酰乙醇胺’ 质粒扩增试剂 * ’ 0 $ 6) M N A I F9公 司 * 盒’ 美 国 OA 胎牛血清’ 杭州四季青生物 0 9 I D G公 司 * 制 品 公 司* 0 Q R . S @ 7 ) PJ $ PM P 培养基’ T A ? : B公 司* 0 "W L U &蛋白分析试剂盒’ ) A D V : D公 司 * M P# 日本电子* 激光粒度测定 Q S S 0 N X 透射电子显 微 镜 ’ 仪 P9 英 [ S ’ 国 P9 * 0 8 K D V G; D E 9 Y A Z D V%9 G B; N 8 K D V G 日本岛津* 倒置显微镜 0 # = S S S荧 光 分 光 光 度 计 ’ 7 1 日 本* 美 国 伯 乐* ’ ! 0 = = S酶 标 仪 ’ 0 68 A F5 \ Y PB ] D 8 水平凝胶电泳仪 ’ 美国法玛西 Q S S凝胶成相系统 ^ N X 亚* " 2 3 2 质粒 _ ‘ a 的扩增和纯化 质粒 5 包含 3 = .> 67 1 8 9 : ;是 < ?真核表达载体 ! 其报告基 因依赖 M 有报告基因 8 ! # Q ^ 9 : ; 1 b cd ( e杂 交 启动子启动 "采用 f 菌株 $ 扩增质粒 ! 采 3 g h i j c= b 用M 分离纯化质粒 ! 并 G ] B 1 V D D OA 9 I D GT A I 9试剂盒 ! 用紫外分光光度法和凝胶电泳法对质粒的纯度和含 量进行了测定 ! 纯度符合要求 " 2 3 k 阳离子脂质体 l _ ‘ a 复合物的制备 取一 定 量 的 $ 用适量的氯仿溶 ! 6) M和 $ $ &L 解! 经 旋 转 蒸 发 和 真 空 干 燥 后 得 到 脂 质 薄 膜0 用Q S nQ 缓冲 液 水 合脂 膜 后 得到 m( cD ’ p . * FFB 8 5 D Y 5 co 的空 白 阳 离 子 脂 质 体 ! 再分别挤压通过 , S S和 Q S S 的 聚 碳 酸 脂 膜 得 到 大 小 均 一 的 空 白 阳 离 子 脂 ! G F 质体 " 将适量的 $ %& 与空白阳离子脂质体等体积混 万方数据 合! 室温孵育 , SFA G后 即 得 到 阳 离 子 脂 质 体 # $ %&
nQ 在, ’ Q SFFB m( *稀释后加入样品池 ! = | 下重复 8 测定 <次 "
道不多 ! 国内尚未见报道 " 经典的 ( ) $ 传递系统使 用的聚阳离子是多聚赖氨酸 0 本文以 1 $ & 已批准可 供 临 床 使 用 的 鱼 精 蛋 白 为 聚 阳 离 子 成 分! 研究了 并对 ( ( ) $ 的构建方法 ! ) $ 和阳离 子 脂 质 体 # $ %& 复合物对体外细胞的转染率进行了比较 "
+ , -. /
复合物 " 2 3 q 凝胶阻滞实验 将阳 离子 脂质体 与质粒 $ %& 按 不 同 重 量 比 形 用Q 成的阳离子脂质体 # r 的琼脂糖凝 $ %& 复合物 !
的又一种新型非病毒载体
胶 进 行 电 泳! 每孔上样量为 S p =s S I$ %&" 电 泳 . 用 溴化乙锭 ’ 染色 ! 紫 外灯下 观察 ! 以确 * FA G后 ! M L 定阳离子脂质体与质粒 $ %& 的配比关系 " 2 3 t u v _ 的制备 将一定比例的空白阳离子脂质体和鱼精蛋白的 溶 液混合 后 ! 加入 等体积 的 $ cD 5 D Y %&! $ %& 的终 浓 度为 < 轻微振荡后 室温孵育 即 Ss ^ ! ! , SFA ! I F8 G 得到 ( " ) $ 粒径和 x 2 3 w 形态 @ y z {电位 阳 离 子 脂 质 体# ) $样品适当 $ %& 复 合 物 或 ( 稀释后 ! 滴加在覆盖碳膜的铜网上 ! 用, r 磷钨酸负 染! 在透射电镜下观察微粒的形态和大小 " 阳离子脂 质体 # $ %& 复 合 物 和 ( ) $的粒径及表面 电 荷 用 激 光 粒度仪测定 " 取, 的样品用 ,F8 缓冲液 Ss 8 cD 5 D Y
采用薄膜 / 挤压法 制 备 空 白 阳 离 子 脂 质 体 后 * 再分别制得阳离子脂质体/ 聚阳离子/ 0 12 复 合 物 和 脂 质 /
用凝胶阻滞实验* 确定阳离子脂质体与质粒 0 / / * . B 0 12 复 合 物 ) 3 4 5 4 6 5 7 8 9 : ; < 4 7 = 0 12 8 4 5 7 5 7 8 9 5 8 > ? > @ 3 A 0 12 的 配 比B 用透射电镜观察阳离子脂质体 / 复合物和 的形态 用激光粒度仪测定它们 的 粒 径 和 电 位 用酶标 * B 0 12 3 A 0 C > < ; 仪测定它们对张氏 ) 肝细胞G . D E ; = F H> 5 I’肝 癌 细 胞 的 转 染 率 J 结 果 表 明 阳 离 子 脂 质 体 / 0 12 复 合 物 和 3 A 0的 形 态均近似于球体 * 但3 肝 细 胞 和 H> . 3 A 0对 张 氏 ) D E ; = F A 0 的粒径明显 较 小 B 5 I’肝 癌 细 胞 的 转 染 率 均 高 于 阳 离 子 脂质体 / 0 12 复合物 J3 A 0 是基因治疗的临床应用中一种更具前景的载体系统 J 关键词 阳离子脂质体 / 0 12 复合物 脂质 / 鱼精蛋白 / 0 12 复合物 转染率
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K T M N[ T N k # T Qm h n o M N kn o T L U N k [ hp T M U qQ T m h r h M N
*| * & , , & *w . ’ ) u y v { ! y } x ’ { z(z y ) t $ u y v & w x t z * + ’ + x y z { st u v w x y z {,~
! K L M N O P Q R S T U NV P P T R T Q N R WX U YZ M L T O U NU P X M S T U N T R[ T Z U O U YQ " # $ ! ! X U YZ \ Q ] Q O M N ^[ T Z T ^ _ L U S M YT N Q " # $X U YZ \ Q ] Q O ‘ ab c d e f
j 引
言
一直是突破其临床有效治疗的关键之一 J 目前 * 广泛 使用的基因载体主要分为病毒载体系统和非病毒载 体系统 J 非病毒载体系统因其具有使用方便 G 安全性 其 中* 阳 离 子 脂 质 体/ 0 12 复 合 物 是 目 前 研 究 得 最
& H 为广泛的非病毒载体系统 G 其优点在于 E 制备工艺 J
高G 可大规模生产和无免疫原性等优点而备受关注 *
简 便* 可 运 载 不 同 大 小 的 基 因 片 段* 可运载质粒
万方数据
还 可 运 载 染 色 体 或 细 胞 核* 其内容量大大超 0 12* 过 其它载 体 B 可 抵 御 核 酸 酶 的 作 用* 延 缓 基 因 降 解B
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