多肽型阳离子脂质体的研究进展赵轶男, 张树彪, 崔韶晖, 王胜男, 孙 杨(大连民族学院生命科学学院,辽宁大连116600)摘 要:多肽型阳离子脂质体作为一种重要的非病毒基因载体,克服了其他阳离子脂质体转染效率低、具有一定细胞毒性的缺点,在基因转运方面具有广阔的应用前景。

在近年来多肽型阳离子脂质体研究的基础上,论述了多肽型阳离子脂质体在类脂的结构设计、脂质体制备及其在基因转运方面应用的研究现状,展望了多肽型阳离子脂质体的发展方向。

关键词:多肽;阳离子脂质体;非病毒载体;基因转运中图分类号:R 941 文献标志码:A 文章编号:0367 6358(2010)11 0701 04T he Development of Poly peptide Cationic Liposom eZH AO Yi nan, ZH AN G Shu biao, CU I Shao hui, WANG Sheng nan, SUN Yang(Colle ge of L if e S cience ,Dalian N ationa lities Univ er sity ,L iaoning Dalian 116600,China)Abstract:As an impo rtant non viral gene v ecto r,poly peptide catio nic lipo som e has ov ercome som e disadvantag es of o ther cationic liposomes,such as low transfection efficiency and cell tox icity ,and show n a potential application in disease treatment and g ene transfer.Based on the studies of recent years,sum marizes the latest development of po lypeptide catio nic liposome for gene deliv ery ,including the str ucture design of po lypeptide lipid,liposomal preparation and the applicatio n in the field of gene transfer,and it also g ives som e sugg estio ns on the dev elo pment trend of poly peptide catio nic liposo me for g ene delivery.Key w ords:poly peptide;cationic liposome;non v iral vector ;g ene transfectio n收稿日期:2010 05 15基金项目:国家自然科学基金(20876027)、教育部新世纪优秀人才支持计划(NC ET 08 0654)作者简介:赵轶男(1979~),女,硕士,研究方向:非病毒基因载体。

E m ail:yin anz hao@dln 基因治疗已成为许多不治之症的重要治疗方法,而载体系统是该方法能否成功的关键,主要包括病毒载体和非病毒载体。

病毒载体例如腺病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体已被用于临床试验[1]。

然而,有报道病毒载体存在一些副作用,包括免疫反应及感染[2],并且大量获得重组病毒载体相对困难。

阳离子脂质体是一种非病毒载体,具有类细胞结构和生物膜的特性,在体内可降解,可以保护其运载基因片段的生物活性[3]。

另外,该方法操作简单、重复性好,阳离子脂质体是一种有临床应用潜力的基因转染载体。

肽及其衍生物在抑制癌细胞的转移、抗血栓、治疗急性肾衰、抗炎及皮肤再生等方面的研究已有越来越多的报道,但由于游离小肽在体内易被酶降解,在几秒内就被清除,生物利用度低,且不具备靶向性,难以实现其药用价值。

然而以氨基酸或肽制备阳离子脂质体,能延长其在体内的半衰期和增强靶向性。

多肽型阳离子脂质体作为非病毒基因载体中重要的一种,因操作简便,转染的安全性和高效性而得到研究人员的广泛关注。

本文综述了多肽型阳离子脂质体在类脂结构设计、脂质体的制备及其在基因转运方面应用的研究现状,为多肽型阳离子脂质体的深入研究提供参考。

1 多肽型阳离子类脂多肽型阳离子类脂是由极性头部、连接键和疏水尾部三部分构成。

极性头部由氨基酸、多肽组成,起着脂质体与DNA 、脂质体 DNA 复合物与细胞膜或与细胞内其他组分相互结合的作用。

基因表达效率与阳离子类脂的氨基酸、多肽头部有关。

连接键通常选择醚键、酯键或酰胺键,连接键决定了阳离子类脂的化学结构稳定性和生物降解性[4]。

如N [1 (2,3 二油酰氧)丙基] N ,N ,N 氯化三甲铵(DOT MA )和双十八烷基溴化铵(DDAB)含有醚键或C N 键,化学稳定性好,但不能被生物降解,不适用于体内实验。

含有酯键的阳离子类脂较易被生物降解,细胞毒性小,但它们的化学稳定性通常较差。

因此,常采用含有稳定的、生物可降解的连接键,如酰胺键和氨甲酰键。

疏水尾部主要由双链烷基或胆固醇衍生物所组成。

双链烷基通常是C 18、C 16、C 14或C 12单位长度,既可以是完全饱和的碳链也可以含有双键(例如oleyl 基团),并且都是对称的;胆固醇有维持类脂排列有序化、保持脂双层膜刚度的性能。

目前已有的多肽型阳离子类脂结构种类很多。

例如以精胺或亚精胺用作极性头部的阳离子类脂,典型化合物有DOGS (dioctadecylamido gly cy l spermine )、DPPES (dipalm itoy l pho sphatidy l ethanolamido spermine)[5](如图1);以氨基酸为头部的阳离子类脂,例如以赖氨酸或精氨酸作为极性头部(如图2)[6];以多肽为极性头部的阳离子类脂,如图3为多肽Lys Lys Lys 、Peptoids 用作极性头部[6]。

DOGSDPPES图1 D OGS 和DPP ES的化学结构LysineArginine图2氨基酸为极性头部的阳离子类脂化学结构Peptide bosedgeminiPeptoids图3 多肽头部的阳离子类脂化学结构2 多肽型阳离子脂质体的构建阳离子脂质体是用量最大、研究最广泛的非病毒载体,由阳离子类脂组成。

多肽型阳离子类脂可以单独形成脂质体,但是很多时候它们都和助类脂一起使用,如二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、磷脂酰胆碱(PC),这些中性磷脂起到稳定双层膜和降低阳性成分毒性的作用,同时提供阳性类脂的细胞渗透功能。

DOPE 是应用最广的中性磷脂(如图4),在阳离子脂质体介导基因转染中起到关键作用[7]。

H uang [8]报道了类脂聚合物单独存在时不能转染细胞,加入DOPE能克服解决这个问题。

图4 DOP E 的化学结构多肽型阳离子脂质体的制备方法有很多,常用的有薄膜法(thin film ,TF )、复乳法(doubleemulsion,DE)、逆相蒸发法(reverse phase evapo ration,REV)和冰冻熔融法(freeze thaw ing, FT)等,各种方法均有各自的优缺点。

毛孙忠[9]以包封率(encapsulatio n percentag e,EN)为观察指标,比较了TF、REV、DE和FT制备L 精氨酸脂质体时EN的变化,优化了最佳的制备条件。

之后又探讨了精氨酸脂质体对慢性低氧高二氧化碳性大鼠肺动脉高压及右心室壁结构重建的影响,为脂质体防治肺动脉高压提供了思路[10]。

3 多肽型阳离子脂质体作为基因载体的研究进展1982年,Folda[11]首次报道了利用氨基酸酯的氨解反应,使氨基酸在脂质体表面进行缩聚,得到表面为多肽的脂质体,但由于缩聚后亲水性降低,脂质体易沉淀。

1986年Neumann[12]先后合成了一系列氨基二羧酸化合物,形成脂质体后用缩水剂缩合,余下的另一羧基可作为亲水基团,得到稳定的多肽型脂质体,从此多肽型脂质体得到快速发展。

近年来, Brito[13]以赖氨酸为头部,与DTAB结合制备阳离子脂质体,优化了类脂与DT AB混合最佳摩尔比,在2<DTAB/12 Lys 12<4范围内,脂质体的尺寸在30~40nm,结构稳定,对细胞的转染效率高。

Koppelhus等[14]发现脂肪酸与阳离子多肽结合后能够提高PNA在细胞内的表达效率。

Obata[2]等成功合成了由赖氨酸、组氨酸和精氨酸作为阳离子头部的类脂,并用于递送质粒DNA,结果表明赖氨酸或精氨酸作为阳离子头部的类脂基因表达效率高于传统的转基因试剂Lipo fectamine2000,基因表达效率与阳离子类脂头部有关:赖氨酸>精氨酸>组氨酸。

而且,合成的阳离子类脂与Lipofectam ine 2000比较毒性要低得多。

Kim[15]人报道了一个含有一个天冬氨酸骨架和一个赖氨酸头部的阳离子类脂,它能高效的表达基因并且降低了细胞毒性,后来他们证实了谷氨酸骨架比天冬氨酸更有能力递送核酸[16]。

Carla[17]模仿核酸结合蛋白的结构特征,选择Lys T rp Lys三肽作为阳离子头部合成基因转运载体,这种多肽头部结合DN A的能力达到104M,并显示了很小的细胞毒性,提高了体外基因转运效率。

聚赖氨酸(po ly L lysine,PLL)是一种多肽类聚合物,单独使用PLL作为载体,易产生聚集,不稳定。

H arada[18]用嵌段聚乙二醇(PEG)共聚PLL阳离子与PEG嵌段共聚的聚天冬酸阴离子(PEG. polyaspartic acid)在溶液中自发形成稳定单分散的聚电解质复合物,该离子复合物可作为基因载体。

与PLL/DNA复合物相比,PLL b PEG/DNA复合物更稳定,也更易在细胞中溶解,同时可大大降低对细胞的毒性作用,提高基因的转染效率。

Shiba[19]将经PEG修饰的PLL用于体内基因转染实验,发现PEG/PLL复合物压缩DNA能形成稳定的壳 核状纳米粒子,当DN A与复合物的电荷比为12或14时,即使没有特异性的配体,PEG PLL/DNA 复合物也能有效地将DNA导入肝癌细胞。

精氨酸 甘氨酸 天冬氨酸(Arg Gly Asp,RGD)三肽是细胞粘附蛋白的识别位点,含有RGD序列的许多多肽都具有抗粘附性能,可抑制肿瘤细胞与内皮细胞和基底膜的粘附,加速肿瘤细胞脱附,阻止肿瘤细胞滞留,从而抑制肿瘤细胞的转移。