siRNA 表达载体与阳离子脂质体复合物转染HepG2.2.15细胞实验研究*杨慧 刘明社 张国英 张芸 赵中夫山西长治医学院肝病研究所（046000）E­mail：zhaozf_1226@摘 要：目的 观察针对 HBV X 的 siRNA 表达载体 pGenesil-HBV X 与阳离子脂质体的 复合物对 HepG2.2.15 细胞转染效果及其对 HBVM 表达的影响。

方法 以 pGenesil-siAFP 表 达载体和非转染细胞分别作非特异性序列对照组和空白对照组，用不同配比浓度 pGenesil-HBV X与阳离子脂质体的复合物转染 HepG2.2.15 细胞，荧光显微镜下观察并计算 转染阳性细胞百分率，筛选出最佳转染效率的剂量配比。

于转染后 24、48、72 小时采用时 间分辨荧光免疫测定技术（TRFIA）检测上清液中 HBsAg 和 HbeAg。

结果 pGenesil-HBV X 与阳离子脂质体复合物 8μl：2.5μg 剂量配比组的平均转染率达到了 55.1±4.3％，且不 影响细胞活性；转染后48小时和72小时后该siRNA表达载体对HepG2.2.15细胞表达HBsAg 和 HbeAg 抑制作用显著（P＜0.05）；结论 8μl：2.5μg 剂量配比组的 pGenesil-HBV X与 阳离子脂质体复合物是最佳的转染剂量配比，能有效抑制 HepG2.2.15 细胞表达 HBsAg 和 HbeAg。

关键词：siRNA，转染，阳离子脂质体，HepG2.2.15细胞1. 引 言RNA 干扰技术，是由 21～23nt 组成的双链 RNA 介导的、序列特异性诱发同源基因转录 后沉默（post-transcriptional gene silence , PTGS）的技术。

这一技术为抗病毒治疗提 供了新策略 [1-3] 。

在已报道应用 RNAi 抑制乙肝病毒的实验中大多采用体外转录合成 siRNA 或构建 siRNA 表达载体与病毒基因表达载体共同转染目的细胞的方法 [4,5] 。

这些研究注重对转染阳性细胞 靶基因的抑制效果，较少考虑转染阳性率。

为使 RNAi 抗病毒治疗试验研究能为它的实际应 用提供更有用的证据，我们采用了与共转染不同的试验条件，选用可以持续分泌 HBV 各种病 毒标志物及 HBV-DNA 的 HepG2.2.15 细胞为实验对象，仅转染 siRNA 表达载体，对培养于同 一体系中的转染细胞与未转染细胞上清液 HBVM进行检测。

探讨不同配比浓度 pGenesil-HBV X 与阳离子脂质体 Metafectene 的复合物转染 HepG2.2.15 细胞的转染效率和 RNAi 的抗 HBV 作用。

* 本课题得到山西省自然基金（项目编号：20051114）资助。

2. 材料与方法2.1 主要试剂：高糖型 DMEM 培养基购自美国 GIBCO 公司，新生牛血清购自杭州四季 青生物制品公司，Metafectene 转染试剂购自德国 BIONTEX， HBsAg、HBeAg 荧光免疫分析 试剂盒购自苏州新波生物技术有限公司。

2.2 HepG2.2.15细胞的培养及准备：HepG2.2.15细胞由北京大学医学部病毒研究 室惠赠，本室传代与培养。

HepG2.2.15 细胞生长于高糖型 DMEM 中（含 10％新生牛血清、 2mmol/l 谷氨酰胺、100U/ml 青霉素及 100μg/ml 链霉素），并在 37℃、5％CO2 孵箱中进行 培养。

细胞自复苏后，3-4 天规律传代，随传代次数的增加连续监测相同种植密度细胞上清 液中病毒标志物的变化，传至 7～8 代时病毒表达及复制水平达 HBV-DNA 达 10 7 拷贝时，开 始用于实验。

转染前选择对数生长期细胞，用 0.25％ 胰酶-0.02％ EDTA 消化后吹打成单细 胞悬液，以 4×10 5 密度培养于放置了无菌处理盖玻片的 6 孔培养板中，每孔 2ml。

24 小时 后观察细胞生长铺满孔底面积约 70％时用于转染。

2.3 靶序列的选择：针对 HepG2.2.15 细胞 HBV X 区选择作用靶点。

为了避免只选择 一个序列可能出现无效或低效的情况，我们选用在 Amir shlomai的 RNAi抗 HBV 实验中被证 实有效的 1649 i — GGTCTTACATAAGAGGACT — 为靶点 。

同时以 AFP 1275i — GCATTGGCAAAGCGAAGCT—为与 HBV 无关的内对照作用位点（已经本室证实有效，另文报道）。

2.4 SiRNA 表达载体的构建：构建质粒载体 pGenesil-siHBV X插入的 DNA 模板序 列为：5’-GATCCGGTCTTACATAAGAGGACTTTCAAGACGAGTCCTCTTATGTAAGACCTTTTTTGTCGACA-3’（正义 链），3’-GCCAGAATGTATTCTCCTGAAAGTTCTGCTCAGGAGAATACATTCTGGAAAAAACAGCTGTTCGA-5’ （反义链）；构建质粒载体 pGenesil-1-siAFP插入的 DNA 模板序列为：5’-GATCCGCATTGGCAAAGCGAAGCTTTCAAGACGAGCTTCGCTTTGCCAATGCTTTTTTGTCGACA-3’（正义 链），3’-GCGTAACCGTTTCGCTTCGAAAGTTCTGCTCGAAGCGAAACGGTTACGAAAAAACAGCTGTTCGA-5’ （反义链）。

pGenesil 质粒载体上游限制性酶切位点为 BamHI，下游限制性酶切位点为 Hind Ⅲ。

以重组有 EGFP的 pGenesil-1-siAFP 作非特异性序对照组。

两种载体质粒的构建及酶切 鉴定、DNA 序列分析由武汉晶赛生物工程公司协助完成。

2.5 质粒载体的转染：转染试剂 Metafectene与 pGenesil 质粒载体复合物的剂量配 比在说明书建议范围（2～7：1）内选择， pGenesil-siHBV X与 META的复合物按照可获得 最大转染效率的剂量比进行配制。

2.6 转染效果观察：荧光显微镜下观察不同配比的转染效果，每孔找三个具有代表 性的视野，各观察 100个细胞，计算阳性细胞百分率， 确定出 RNAi实验的最适 Metafectene / pGenesil比例。

2.7 细胞活性测定：0.4％的台盼蓝拒染实验评估细胞活性。

每样本随机取三个视野， 计数其中着色细胞。

细胞活力=（总细胞数—着色细胞数）÷总细胞数×100％ 。

2.8 HepG2.2.15细胞上清液中 HBsAg 和 HBeAg 的监测：采用时间分辨荧光免 疫测定技术（TRFIA）及配套荧光免疫分析试剂盒，分别在转染后 24、48、72 小时对细胞上 清液 HBsAg 和 HBeAg 进行检测。

2.9 统计学处理：数据以 X±S 表示，采用 SPSS 13.0 统计软件作方差分析、q 检验， P＜0.05 认为统计学上有显著差异。

3. 实验结果3.1 不同配比 pGenesil­siHBV 质粒载体与 Metafectene 脂质体针对 HepG2.2.15 细胞转染效率观察及细胞活性测定：在不同配比的转染组中，脂质体转 染试剂剂量越大转染效率越高。

在 8μl： 2.5μg 剂量配比组的平均转染率达到了 55.1±4.3 ％，且不影响细胞活性。

12μl：2.5μg 组平均转染率虽也达到 57.7±3.5％，但该组细胞 活性下降（见图 1）。

15μl：5μg 组细胞发生崩解呈碎片样，无法计算转染率，提示该剂 量配比的细胞毒性作用。

图 1.不同配比转染组转染效率及细胞活性比较3.2 成功转染后，HepG2.2.15 细胞上清液中两种 HBVM­HBsAg 和 HBeAg 时间分辨荧光免疫测定结果显示：以空白对照组对两种 HBVM 的测定值为标准，转染后 24 小时，pGenesil-siHBV X 组 HBsAg 和 HBeAg 的测定值分别与空白对照相比无显著性抑制 作用（P ＞0.05）；转染后 48 小时和转染后 72 小时的测定值分别与空白对照及 pGenesil-siAFP 组相比有显著性抑制作用（P＜0.05）； pGenesil-siAFP 组对两种 HBVM 表达无显著影响（P＞0.05）（见表 1）。

表 1.pGenesil­siHBV X 抑制 HepG2.2.15细胞表达 HBsAg 和 HBeAg 作用（χ±s ）HBsAg HBeAg 组别 孔数 24小时 48小时 72小时 24小时 48小时 72小时空白孔 3 7.13±0.20 14.43±0.56 22.5±21.14 0.43±0.02 0.75±0.06 1.12±0.10 siAFP 3 6.33±0.35a 13.70±0.73a 23.11±1.25a 0.47±0.05a 0.76±0.08a 1.10±0.12a siHBV 3 5.97±0.13a 10.25±0.32b 15.26±0.88b 0.43±0.02a 0.46±0.01b 0.64±0.04ba ：与空白对照相比 P ＞0.05，b ：与空白对照及 pGenesil­siAFP 组相比 P ＜0.05 0.00%20.00% 40.00% 60.00% 80.00% 100.00% 120.00% 3μl：1μg 6μl：1μg 8μl：2.5μg 12μl：2.5μg 转染效率 细胞活性4. 讨论评价某种抗病毒治疗效果的重要环节之一就是要建立一种稳定的、 接近自然感染状态的 体外模型。

Amir shlomai[6]用 pSUPER-siHBV X同含 1.3 倍 HBV 基因组的重组质粒 （pHBV1.3） 共转染 Huh-7 细胞,72 小时后检测 HBsAg 和 HBcAg 表达水平分别下降 60％、89％，所有病毒 转录物减少约 68％， HBV DNA复制水平下降 95％。

Xiaonan Zhang [7] 将整合有 HBV 全基因组48小时后观察HBsAg 和HBeAg 的质粒pHBV3.8与HBVsiRNA表达载体pHBV共转染Huh-7细胞，表达水平平均下降 60％，72 小时分别下降 86％和 83％；重庆医科大病毒研究所的唐霓等 [8] 用 pHBV1.3与 psiHBV共转染 HepG2 细胞，48 小时后观察对细胞上清中 HBsAg、 HBeAg 的抑 制率分别达 92％、85％ 。