[ 4]
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蛋白质的结构与复性
蛋白质在一定的氨基酸顺序的基础上形成非常
复杂的空间立体结构, 其组成中的氨基酸本身的特 性是蛋白质高级结构形成的决定因素和结构基础 , 尤其是处于关键部位的氨基酸 , 对蛋白质的生物学 功能有根本的影响 , 例如镰刀型红细胞贫血症中血 红蛋白氨基酸的变化。因此, 能达到复性的蛋白质 变性应是在保持氨基酸的基本种类和顺序不变的基 础上, 由于其他因素的影响而引起的分子高级结构 的变化 , 如 螺旋、 折叠结构的增减 , 肽链 的变性 舒展 , 杂乱结构的增多, 从而使蛋白质正常的生物学 活性丧失。蛋白质稳定性与组成中的氨基酸种类有 关系, 例如含有巯基的 氨基酸, 最常见的是半 胱氨 酸, 会降低蛋白质在高温条件下的稳定性, 尤其在某 些金属离子 , Cu + 、 Zn2+ 等存在时, 蛋白质对 空气中 的氧更为敏 感, 而易发生不可逆变 性 , 在 此基础 上, 有人通过用丝氨酸、 丙氨酸替换活跃的半胱氨酸 的方法来提高蛋白质的稳定性
参 考 文 献
1 Sandberg A et al . Biochem, 2002; 41: 1060 2 Kretschmar et al .Mol Biol, 1999; 291: 1147 3 Wallace LA et al . J Mol Biol, 2002; 315( 2) : 193 4 Capaldi AP et al . Nat Struct Biol, 2002; 9( 3) : 209 5 Zhu H et al . Chin Med J, 2001; 114( 2) : 186 6 7 9 方敏等 . 生物工程学报 , 2001; 17( 6) : 608 林来兴妹等 . 第一军医大学学报 , 2001; 4: 245 孙叶芳等 . 牙体牙髓牙周病学杂志 , 2001; 2: 73 516 11 Heven DL , Clark EDB. Bitechnol Bioeng, 1997; 54: 221 12 Menzella HG et al , Protein Expr Purif , 2002; 25( 2) : 248 13 Nam SH et al . Protein Expr Purif, 2002 ; 24( 2) : 282 14 Bhutani N et al . J Mol Biol, 2001; 314: 1167 15 Kuzewska J et al , J Mol Biol, 2001; 314: 901 16 Wang K, Abrahan Spector. Eur J Biochem, 2001; 268: 6335 17 Nath D et al . Protein Sci, 2002; 11( 11) : 2727 18 Dong X Y et al . Biotechnol Prog, 2002; 18( 3) : 663 19 Gray LR et al . Expr Purif, 2002; 26( 1) : 179 20 Cho TH et al . Bioseparation, 2001; 10( 4 5) : 189 ( 2003 02 17 收稿 )
2
蛋白质复条件
蛋白质的复性对环境中的理化条件有很高的要
求 , 复性时必须对温度、 pH 、 离子强度等进行严格的 限制 , 同时蛋白质本身的性状也对复性效率产生影 响。朱慧等[ 5] 在研究重组人前尿激酶复性时 , 对不 同复性条件进行实验比较 , 发现强酸强碱均不利于 蛋白质复性, 偏碱 ( pH8. 6~ 8. 8) 、 低温 ( 4 ) 情况下
蛋白质是一种具有复杂的空间立体结构的大分 子物质 , 易受外界条件的影响发生变性。随着基因 工程技术的发展 , 许多实验通过将目的蛋白基因转 入原核或真核表达体系进行表达的方法, 得到需要 的蛋白质, 这大大丰富了蛋白质的来源。但这些蛋 白质, 由于表达体系本 身的原因 , 或实验过程 的处 理, 多以无活性的形式存在, 需要进行复性。因此 , 对蛋白质复性的研究必然的成为从基础的实验室生 物工程研究到最终临床应用过 程中不可避免 的一 步。本文将目前国内外对各种蛋白质复性方面的研 究作一综述。
国外医学分子生物学分册 2003 年第 25 卷第 6 期
等电点 , 因此 , 很难找到一种方法是适用于所有蛋白 质复性的。但蛋白质组成的基本成分是氨基酸, 空 间结构有一定的规律可寻 , 各种蛋白质对外界物理 或化学条件的反应, 蛋白质内部化学键的构键要求 又都有相似性 , 因此各种蛋白质的复性方法可以彼 此借鉴。但对于某一种特定蛋白质来说 , 其最佳复 性方法 , 需要在实验中进一步探索得到。
[ 2] [ 1]
, 蛋白质复性效率就取决于正
确折叠和变性聚集之间的竞争。疏水链暴露后, 肽 链上某些具有 光吸收作用的氨基酸也 暴露于溶液 中 , 会引起蛋白质紫外吸收值发生一定的变化, 根据 这一点, 可以对变复性过程中蛋白质的结构情况进 行观察。蛋白质的变性过程发生是比较迅速的, 只 要几分钟 , 但复性过程却相对较慢 , 需要几个小时, 因此, 复性时要给予足够的时间。
3
复性的辅助剂
变性后的蛋白质由于氨基酸的完整顺序没有变
化, 本身自然存在着向活性蛋白折叠的趋势, 有许多 蛋白质用透析等方法去掉变性环境后, 自身即可完 成复性过程, 最为典型的如核糖核酸酶 , 但对多数蛋 白质来说, 复性需要一些辅助剂的加入。这些添加 剂具有分子量小、 易于和蛋白质结合、 较稳定、 不易 聚集等优点。其作用机制不尽相同。 3 1 二硫键催化剂 各种氧化还原对可以使二硫键在正确位置上氧 化形成 , 象 cysteine/ cystine、 GSH/ GSSG。用此进行复 性时, 不同氧化还原物质之间的浓度比例是决定蛋 白质 复 性 的 重 要 因 素。 孙 叶 芳[ 9] 对 纯 化 出 的 rhBMP 2 单体按 不同实验条件分 8 组进行复性 , 发 现在 10 1 条件下的 GSH( 2 mmol/ L ) 和 GSSG( 0. 2 mmol/ L) 能 最大程 度的促 进 rhBMP 2 的活 性恢复。 在蛋白质 hainantoxin IV. [ 10] 的 复性中, 也验证了 这 一点 ( GSH: 5 mmol/ L, GSSG: 0. 5 mmol/ L ) 。 最近 ,
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国外医学分子生物学分册 2003 年第 25 卷第 6 期
蛋白质复性的条件及影响因素
王 雪 宋长征
山东 省医学科学院医药生物技术研究中心 ( 济南 , 250062) 摘要 蛋白质复性是一个过程 , 存在中间阶 段 , 此 阶段的 各种相互 作用力 决定了 蛋白质 能否复 性。蛋白质 复
性要求有一定的条 件 , 如 pH 、 温度、 离子强 度、 蛋 白质浓度 等。另外多种 添加剂能促 进蛋白质复 性 , 其 中包括表 面 活性剂、 低浓度变性剂、 分子伴侣蛋白和各种氧化还原对 , 但对于不同蛋白质 , 因其 结构及理化 特性不同 , 采取不 同 复性方法 , 可以使其达到最佳复性效果。 关键词 蛋白质 ; 结构与复性
360 剥离掉去垢剂, 蛋白质进行折叠。Dong [ 18] 研究了人 工分子伴侣对溶菌酶复性的影响 , 实验中蛋白质折 叠率随人工分子伴侣浓度上升而增高。 3 3 其他小分子添加剂的作用 有许多小分子添加剂对提高复性产量有帮助 , 它们分子量较小 , 易接近目的蛋白并与之结合 , 而且 具有不易聚集的性质 , 可以带动目 的蛋白的复性。 它们的分子内部大都含有 C= N 、 C= S 等类似共价 键结构 , 如盐酸胍和精氨酸 ( C= N) , 二甲基亚砜 ( S = O) , 乙酰化环糊精 ( C= O) 等, 这种结构可能与蛋 白质疏水基团的结合有关。在对蛋白质进行透析复 性的基础上, 可适当应用这些添加剂。
晶体蛋白
结构的变化 , 释放出目的蛋白, 以利于其他分子伴侣 发挥作用。Nathy 用 晶体蛋白对木聚糖合酶进 行复性 , 并检测复性过程中蛋白质结构的变化情况, 晶体蛋白先与木聚 糖合酶中间体结合形成一无 活性的 融球 状复合物 , 加入 ATP 后, 晶体蛋白 的结构发生变 化, 释放出目 的蛋白。他们 还发现, Ca2+ 可以提高酶活性的恢复 , 虽然体内木聚糖合酶 的复性并不需要 Ca2+ 参与。由此可见 , 蛋白质复性 中分子伴侣的结合遏制了蛋白质的聚集 , 而 ATP 的 加入可使分子伴侣将目的蛋白由结合态游离出来, 进行折叠, 而且, 多种分子伴侣对复性有协同作用。 在分子伴侣作用机制的基础上 , 有人用人工分 子伴侣系统对蛋白质进行复性。人工分子伴侣由去 垢剂和环糊精组成。去垢剂可以与蛋白质结合, 形 成复合体, 抑制蛋白质聚集 , 然后环糊精从复合体中
[ 17] [ 16]
蛋白质复性较好。蛋白质浓度对复性也有影响 , 浓 度越低, 聚集越不易发生[ 6] 。原因是由于蛋白质的 浓度上升时, 分子间相互碰撞的几率增加, 处于中间 状态的蛋白质对聚集又较敏感 , 使蛋白质趋于凝集 而不能正确折叠 , 已复性后的蛋白质分子则不易发 生聚集。但是, 实际的应用要求在高浓度下达到蛋 白质的复性 , 许多人尝试用改变实验步骤的方法来 克服这一问题。朱慧等将复性分步进行, 在一定的 时间间隔下分步加入蛋白质, 给蛋白质有效的时间 进行低浓度下的复性 , 结果提高了复性效率, 并比较 不同的时间间隔, 发现 60min 为最佳。周明乾等 [ 7] 在纯化白介素 2( IL 2) 和粒细胞 巨噬细胞集落刺激 因子( GM CSF) 融合蛋白时, 对溶解变性包涵体通过 一步稀释( 80 倍) 和分步稀释法分别进行复性, 前种 方法目的蛋白有析出 , 回收率低, 其原理也是通过避 免高浓度的蛋白质中间体同时存在于溶液中。蛋白 质分子正确折叠对溶液的离子强度也有要求, 适当 盐 浓度 有 利 于 蛋 白 质 内 部 各 种 化 学 键 的形 成。 Tayyab[ 8] 用 1. 0 mol/ L KCl 显著提高了在脲素中变性 的牛血清白蛋白的复性效率。国内孙叶芳[ 9] 对在大 肠杆菌中表达的重组人骨形态发生蛋白 ( rhBMP 2) 进行纯化及 复性时 , 结果显示高盐 不能使 rhBMP 2 获得 良好复性, 其他条件相同时 , 0. 75~ 1. 25 mol/ L 的 NaCl 最有利于蛋白二聚体的形成 , 活性最高 , 因 此, 溶液中的盐也是蛋白复性中应考虑的一项重要 因素。