蛋白质复性方法及其注意事项
蛋白前期准备
(1)査阅U标蛋白相关文献，了解其等电点，标签等注意点。
(2)如果日标蛋白易降解，可在纯化时加l-2mMDTT,全程低温，及时处理.
(3 )透析Buffer得选择可参考文献。
蛋白复性
包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊得生物大分子，它们
致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性得结构称
为包涵体(Indus! on Bod i es» I B)。
在E、co li中累积得重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包
涵体蛋白就是丧失生物活性得不可溶得错误折叠蛋白得聚集体.
包涵体得处理一般包括这么儿步:包涵体得洗涤、溶解、纯化及复性。
如果过表达蛋0在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：(2)退一步/尤化
表达条件；(2)接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性•这里主要考虑第二
种方案。
包涵体得洗涤
破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物
降解，导致天然物质量得减少,加入蛋0酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于U得物质得提取。
2mM EDTA, 2mM D 洗涤Buf f e r :50mM T r i s -H CI (pH8、0),
TJr 1 5 0 mM NaCI, l%Tn t on X—1 0 0, Img/ml Lwupe p t in^ Img/ml P
epstat in, ImM TCER
超声时用40— 6 0 ml裂解液'因为我们得超声仪很适合用1 0 0 ml小烧
杯，装4 0-60m I裂解液，这样能让超声头离液面不高不低，不会洒出来、菌
多就延长超声时间(全程冰浴)•
包涵体得溶解
I、对于尿素与盐酸M得选择:
尿素与盐酸属中强度变性剂，易经透析与超滤除去。
它们对包涵体氢键有
较强得可逆性变性作用，所需浓度尿素8-1 0M.盐酸肌6-8M。
尿素溶解包涵
体较盐酸慢而弱，溶解度为7 0 — 90%,尿素在作用时间较长或温度较高时会裂
解形成氤酸盐，对重组蛋白质得氨基进行共价修饰/旦用尿素溶解具有不电离，呈
中性，成本低，蛋口质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解得包涵体可
选用多种色谱法纯化等优点，故U前已被广泛采用。
盐酸M溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质得共价修
饰。
但它也有成本高.在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白
质沉淀与对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。
2、去垢剂:
温与去垢剂Tr i tonX-I 0 0洗涤去除膜碎片与膜蛋0。
如强得阴离子去
垢剂SDS,可以破坏蛋白内得疏水键，可以增溶儿乎所有得蛋白。
问题就是山
于S DS无法彻底得去除而不允许在制药过程中使用。
包涵体得复性
1复性:
通过缓慢去除变性剂使U标蛋0从变性得完全伸展状态恢复到正常得折
叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。
2复性得效率:
复性就是一个非常复杂得过程,蛋口质得复性效率在20%左右•影响复性
效率得因素有蛋口质得复性浓度，变性剂得起始浓度与去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂与其她添加剂得存在与否等。
4、复性中常采用得方法有: 稀释复性:直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点就是体积增
加较大，变性剂稀
释速度太快，不易控制。
透析复性：好处就是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去
除速度，缺点就是易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。
超滤复性：在生产中较多得使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺
点就是不适合样品量较少得悄况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆得变性。
柱上复性：就是最近研究较多并成功得在生产中应用得一种复性方法，常用
于复性得层析方法有SEC、HIC等。
复性得具体方法还要根据前期试验及筛选来确定!
包涵体得复性还要注意以下几点：
首先要获得较高纯度得包涵体.
2、包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要
有助溶描施。
3、复性前后均要离心
4、复性不能太快、
5、纯化得最佳条件要摸索与结合相关文献。
6、变性蛋白得浓度
浓度不要太高，一般0、4・0、5mg/ml左右较适宜,若浓度高了，可稀释至适宜浓度。
有些蛋
白可能更低，此时需要结合文献与实践，确定最佳浓度。
要结合透析询后得浓度,如果透析液
加入甘油，这需要结合浓缩比（W%甘油可浓缩2 0%左右）.
复性Buffer得选择
包涵体复性液配方
对于包涵体复性，一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2 M 左右时结束。
对于盐酸肌而言,可以从4M开始，到i、5M时复性过程已经结束。
Tris 系统与PBS系统都没有明确得规定，这些需要您在实验过程中不断试验，确定
合适得缓冲系统；复性过程主要就是注意以下儿个问题:
<1）最适pH值范用为8、0-9. 0之间；（有时需要过酸或过碱性）
（2）温度适宜选择4°C；
（3）复性过程蛋白浓度不宜过大：（小于0、5 mg/ml为宜）
（4）复性时间一般为2 4 —36小时;
（5）低分子化合物如L-Arg有助于增加复性中间产物得溶解度：JK、盐酸M 等，在非变性浓度下就是很有效得促进剂，都可阻止蛋0聚集;hi S对蛋白质复性有促进作用。
（6）氧化还原体系如GSH/GSSG、DTT/GSSG等•常用得氧化方法有：空气氧化法:在碱性条件下通空气，或者加入二价铜离子，能够取得更好得效果，缺点就是不易控制氧化还原电势•
氧化还原电对（redox）:常采用G S SG/GSll（l： 5 - I : 10）,通过调整两者
得比例来控制较精确得氧化还原电势，也可以在添加了还原剂如DTG如:5rnM
GSSG/2mMDTT = G SH/GSSG（1> 3 3/1）。
（7）复性过程得添加剂：
1、共溶剂：如PEG 6 0 0 0 -200 0 0,据说可以可逆得修饰折叠中间体得疏水集团，此外山于阻止了蛋白质分子间得相互接触得机会，也可能对复性效率得提高起作用。
一般得使用浓度在0、1%左右，具体条件可根据实验条件确定。
2、0、4—0、6 M L—Arg：促进蛋G溶解，（成功得应用于很多蛋白如t -PA得复性中，也可以抑制二聚体得形成。
）
3、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在5%—30%.
4、一定得盐浓度，可能就是为了降低某些带电集团间得斥力，有利于蛋白
质得折叠.
5、辅助因子：添加蛋白质活性状态必须得辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配
体等（如分子伴侣等）很多时候对蛋白质正确得折叠就是有利得。
6、特殊离子:如CaCb，Mg Cl2等特殊得金属离子，可参与蛋白质得正确
折叠，促进活性得作用。
（此时勿加入EDTA.）
例如复性Buffer：
SOmMTris—HCI (p H8、0), 10m M CaCl/O、4 M L—Arg, 2 mM GSH / 0、4mM GSSGJO%甘油。
透析buffer： 5 0 mM Tris-HC 1 ( p H &0)jOmM CaCb，2mM DTT, 1 0 %甘油.
复性中蛋白析出!
出现蛋白析出，肯定就是条件变化太剧烈。
复性应该采取复性液浓度与pH值逐渐变化得方法，例如根据包涵体得溶液成分，每隔1个pH或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。
此外透析时必须浓度极低，条件温与，使蛋口质能够正确折叠。
{I）蛋口析出最大得可能性：蛋口浓度太高，建议稀释以后再复性；
（2 ）透析得盐浓度（比如urea）要平缓降低:8M—6M—2M —PBS；
（3）若加变性剂（尿素可加到2M,盐酸脈可加到1-1、5M）;
（4）另外可将甘油浓度增加（范H可在W30%）,且在复性样品中也可加适量甘油；
（5）如果还不行，可以换新得复性缓冲液；
（6）纯度不够!出现纯化得U标蛋0纯度不够时，可以先过分子筛再复性；带有二硫键蛋白得复性！
如果蛋口中存在两个以上得半胱氨酸,立即形成正确得二硫键就是不可能得。
随着二硫键得数U增加（分子间与分子内得），可能得组合数U也在剧烈上升（3个二硫键就就是15种可能组合，4个对应1 05,5个对应9 45等等）。
如果二硫键就是正确折叠所必须得话，应该在溶解时加入一种还原性试剂
（如1 OmM DTT）O这种还原性试剂能够被复性用二硫化物置换试剂所取代。
加入二硫化物置换试剂（如氧化型+还
原型谷胱甘肽）就是为了提供氧化还原作用力。
这些试剂同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体。
这些二硫键得形成或断裂反应就是可逆得，直到最有利得蛋白二
硫键形成,这种平衡才会被破坏•这个过程被称作氧化型折叠.。