生物化学实验讲义赵国芬2010年9月实验之前说明1.各班学习委员将成员分成10个大组,每个大组中2人一小组,大组采用循环实验的方法,同时开出不同的10个实验.2.共开出10个不同的实验实验一温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响实验二牛奶中蛋白质的提取与鉴定实验三血液葡萄糖的测定-福林（Folin）-吴宪氏法实验四双缩脲测定蛋白质的含量实验五血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳实验六植物组织中还原糖和总糖的含量测定实验七应用纸层析法鉴定动物组织中转氨基作用实验八植物组织中维生素C的定量测定实验九琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察实验十植物组织中DNA的提取和鉴定3.穿着要利索,做好实验记录4.注意实验室卫生和安全.一. 实验室规则:按照实验室的规则给学生讲解.二. 生物化学所用的实验技术1.样品: :血液、血浆、血清、组织植物样品：果实、花蕾、茎等无论用什么做材料，为了提取物质，需匀浆2．移液管的使用：移液管吸管移液管奥氏吸管读数时视线与凹面相平，取液时要用吸管嘴吸，放出液体时注意嘴部液体的残留问题。

3．离心机的使用：平衡（管平衡、机器平衡）缓起和慢停4．分光光度计机器原理和测定原理（比尔定律）5．水浴锅的使用三、实验报告的书写（用教务处统一印刷的报告纸写）目的、原理、仪器、药品、步骤、结果及结论、讨论实验一、温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响一、实验目的通过本实验了解酶催化的特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对酶活力的影响，对于进一步掌握代谢反应及其调控机理具有十分重要的意义。

二、实验原理酶的化学本质是蛋白质。

凡是能够引起蛋白质变性的因素，都可以使酶丧失活性。

此外，温度、pH和抑制剂、激活剂对酶的活性都有显著的影响。

酶的活性通常是用测定酶作用底物在酶作用前后的变化来进行观察的。

本实验用唾液淀粉酶作用的底物—淀粉，被唾液淀粉酶分解成各种糊精、麦芽糖等水解产物的变化来观察该酶在各种环境条件下的活性。

淀粉被酶水解的变化，可以用遇碘呈不同颜色来观察。

淀粉遇碘呈蓝色;糊精按分子从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色;最小的糊精和麦芽糖遇碘不呈现颜色反应。

三、试剂1.0.5%淀粉溶液2.碘化钾－碘溶液3.1%尿素溶液。

4.1%CuSO4溶液5.磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液pH5.0-8.0:6.0.5%NaCl溶液。

7.唾液淀粉酶制备每人用自来水漱口3次，然后取20m1蒸馏水含于口中，半分钟后吐入烧杯中，纱布过滤，取滤液lOml，稀释至2Oml为稀释唾液，供实验用。

四、操作步骤一、温度对酶活性的影响（一）淀粉酶的观察1、取3支大试管，编号后按表操作2、在白色比色板上，置碘液2滴于各孔中，每隔1分钟，从第二管中取出反应液1滴与碘混合，观察颜色变化。

3、待第二管中反应液遇碘不发生颜色变化（即只呈碘的颜色）时，向各管中加入碘液1滴，摇匀，观察并记录各管颜色，说明温度对酶活性的影响。

结果与分析：结果：各管颜色分析：为什么比如：结果与分析：1号中为兰色，2号为无色，3号为兰色说明37℃为淀粉酶的活性最高的温度，淀粉水解的速度最快，其它2个温度淀粉酶的活性低，淀粉几乎没有水解。

二、pH对酶活性的影响1、取试管1支，加入pH6.8的磷酸缓冲溶液3m1、0.5%淀粉溶液2ml，混匀。

放置于37℃水浴中保温3分钟。

再加入稀释唾液2ml，混匀，继续保温，每隔l 分钟取出1滴于白瓷板上，加碘液1滴，观察淀粉水解的程度，直至碘不变色，记下保温时间。

2、另取试管5支，编号，按编号顺序分别加入pH5.0、 6.2、6.8、7.4、8.0的磷酸盐—柠檬酸缓冲溶液3m1，每管加入0.2%淀粉溶液2m1。

置37℃水浴中保温3分钟后，以1分钟的间隔，依次向1-5号试管中加入稀释唾液2m1，摇匀，37℃水浴中保温。

参照上述第一步实验的保温时间，到时迅速取出，并立即加入碘液2滴，充分摇匀，观察各管呈现的颜色，判断在不同pH条件下淀粉的水解的程度。

可以看出pH对唾液淀粉酶活性的影响，并确定最适pH。

结果与分析：结果：各管颜色分析：为什么三、酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响1.取小试管3支，按表操作2.将3支试管放入37℃水浴中，并在白色比色板上用碘液检查第二管，待碘液不变色时，向各管中加碘液1滴，观察水解情况，记录并解释结果。

结果与分析：结果：各管颜色分析：为什么实验二牛奶中蛋白质的提取与鉴定一、实验目的学习从牛奶中制备酪蛋白的方法并进行鉴定试验二、实验原理牛乳和羊乳中含丰富的蛋白质，其中主要是酪蛋白。

酪蛋白在其等电点pH溶液中溶解度降低。

所以，将牛乳的pH调整至4.8，即酪蛋白的等电点时，酪蛋白即沉淀出来。

用乙醇除去酪蛋白沉淀中不溶于水的脂肪，得到纯的酪蛋白。

所得酪蛋白供定性鉴定。

除去酪蛋白的滤液中，尚含有球蛋白、清蛋白等多种蛋白质。

三、试剂1.醋酸钠缓冲液 (0.2mol/LpH4.6)2.米伦(Millon)试剂3.95%乙醇。

4.乙醚。

5.1O%NaCl6.0.5%Na2C03。

7.0.lmol/LNaOH。

8.0.2%HCl9. 饱和氢氧化钙 (Ca(OH)2)。

10. 5%醋酸铅。

四、实验操作(一)酪蛋白的制备取新鲜牛乳2Oml，放人100ml烧杯中加热至40℃。

加入2Oml 加热至同样温度的醋酸缓冲液，一边加一边摇动，并用pH计检测，调整混合液的pH为4.8（实际中准确加入牛奶与醋酸缓冲液体积相同时，可以不用调节pH）。

冷却至室温，继续放置5分钟，然后将溶液转入离心管中离心3000r/min，时间5分钟（注意离心时要对角配平），离心后清液保留做鉴定实验。

所得沉淀物悬浮在约30ml等量的醇醚混合液中，搅匀，离心3000r/min，时间5分钟，弃清液，所得沉淀摊在表面皿上，使醇醚混合液挥发。

（二）酪蛋白的性质鉴定1.溶解度取试管6支，分别加入水、10%氯化钠、0.5%碳酸钠、0.1mol/L 氢氧化钠、0.2%盐酸及饱和氢氧化钙溶液各2m1。

于每管中加入少量酪蛋白。

不断摇荡，观察记录各管中的酪蛋白溶解度。

2.米伦反应取酪蛋白少许，放置于试管中。

加入lml蒸馏水，再加入米伦试剂10滴，振摇，并徐徐加热。

观察其颜色变化。

3.含硫 (胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸)测定:取少量酪蛋白溶于lmlO.1 mol/L 氢氧化钠溶液中，再加入1-3滴5%醋酸铅，加热煮沸，溶液变为黑色。

(三)乳清中可凝固性蛋白质的鉴定将制备酪蛋白时所得的清液移入烧杯中，徐徐加热。

即出现蛋白质沉淀。

此为乳清中的球蛋白和清蛋白。

实验三、血液葡萄糖的测定-福林（Folin）-吴宪氏法一、实验目的学习并掌握福林-吴宪氏法测定血液中葡萄糖的方法二、实验原理葡萄糖(C6H126)是一种多羟基的醛类化合物。

其醛基具有还原性，与碱性铜试剂混合加热，葡萄糖分子中的醛基被氧化成羧基，而铜试剂中的二价铜(Cu2+')被还原成砖红色的氧化亚铜（Cu2O）而沉淀。

氧化亚铜可使磷(砷)钼酸还原生成钼蓝，使溶液呈蓝色。

其生成蓝色的深度与血滤液中葡萄糖浓度成正比。

选用颜色深浅较接近于测定管一同在420nm比色，即可求出测定管中葡萄糖的含量。

三、试剂 "1.1/24mol/L硫酸溶液2.10%钨酸钠溶液3.碱性硫酸铜试剂4.磷钼酸试剂5.0.25%苯甲酸溶液6.葡萄糖贮存标准液 (lOmg/ml)7.葡萄糖应用标准液(0.lmg/ml)8. 1：4磷钼酸稀释液四、实验步骤：1. 用钨酸法制备1：10全血无蛋白滤液(相当于将原血稀释了10倍)。

2．4支血糖管按表操作用1：4磷钼酸溶液加至25刻度处后，用橡皮塞塞紧管口颠倒摇匀，用空白管调零，在420nm波长处进行比色，读取各管的密度值（光吸收值）。

3. 计算高标准管：低标准管：实验四双缩脲测定蛋白质的含量一、实验目的掌握双缩脲测定蛋白质的方法和原理二、实验原理双缩脲在碱性溶液中与Cu2+产生紫色的络合物,这一反应称“双缩脲反应”。

蛋白质分子中肽键，也能与Cu2+ 发生双缩脲反应，溶液紫色的深浅与蛋白质含量在一定范围内成正比，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关。

该紫色的络合物在580nm处有最大吸收值，通过测定580nm处的吸光值用于谷物蛋白质含量的测定。

三、器材分光光度计分析天平移液管具塞三角瓶漏斗三角瓶四、试剂10%KOH溶液、无水乙醇、碳酸铜、酪蛋白、豆粉五、实验步骤：(一)标准曲线的绘制按下表加入各试剂，振荡10min，静置片刻，将上清过滤后580nm测定吸光值。

以吸光值为横坐标,酪蛋白含量为纵坐标,绘制标准曲线。

六、结果计算标准曲线上查得蛋白质含量（g）样品蛋白质含量（%）= ×100豆粉（g）实验五血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳一、实验目的学习醋酸纤维薄膜电泳的操作技术，了解电泳技术的基本原理，测定人血清中各种蛋白质的相对含量。

二、实验原理醋酸纤维薄膜电泳(CAME)是以醋酸纤维薄膜(CAM)作支持物的一种区带电泳技术。

本实验以醋酸纤维素薄膜为电泳支持物，分离人血清蛋白。

血清蛋白中含有清蛋白、 α－球蛋白、β－球蛋白、γ－球蛋白和各种脂蛋白等。

各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及行状不同（见下表），在电场中的迁移速度不同。

分子量小、等电点低的，在相同碱性PH 缓冲体系中，带负电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。

例如人血清蛋白在PH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。

清蛋白泳动最快，其余依次是12,,,ααβγ----球蛋白（如图）。

三、材料、仪器与试剂 （一）、材料：人血清 （二）、仪器醋酸纤维薄膜(8×2mm)；点样器；染色皿，漂洗器，镊子；玻璃板；常压电泳仪；直流电源整流器；水平电泳槽；粗滤纸；直尺和铅笔（三）、药品巴比妥缓冲液(pH8.6)；氨基黑10B 染色液；漂洗液，洗脱液 四、实验步骤：1.浸泡:用镊子取醋酸纤维薄膜放在缓冲液中浸泡20分钟。

2、点样:把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后铺在玻璃板上(无光泽面朝上)，将点样器在血清中沾一下（量薄薄一层为好），再在膜条一端2-3厘米处轻轻水平地落下并随时提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。

3、电泳：在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上。

膜条点样的一端放在负极上。

通电，电流强度每条膜2－2.5mA(注意强度),电泳时间约为90分钟。

4、染色:电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡5分钟。

5、漂洗:将膜条从染色液中取出后移置到漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可得到色带清晰的电泳图谱。

结果:实验六植物组织中还原糖和总糖的含量测定（3，5－二硝基水杨酸法）一、实验目的掌握还原糖总糖测定的基本原理，学习比色定糖的基本操作。