实验一蛋白质和氨基酸的呈色反应一、目的要求(1)学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。

(2)学习几种鉴定特定氨基酸的特殊颜色反应及其原理。

二、原理㈠蛋白质和氨基酸鉴定常用方法蛋白质所含有的某些氨基酸及其特殊结构，可以与某些试剂反应、生成有色物质。

1．双缩眠反应当脲(即尿素)加热至l80℃时．两分子脲缩合，放出一分子氨而形成双缩脲(biuret)。

然后在碱性溶液中与铜离子(cu2+)结合生成复杂的紫红色化合物。

这一呈色反应称为双缩脲反应。

紫红色铜双缩服复合物分子结构见下页图。

蛋白质或二肽以上的多肽分子中，含有多个与双缩脲结构相似的肽键，因此也有双缩脲反应。

应当指出，含有—个CS—NH2、一CH2一NH2，一CRH—NH2，一CH2一NH2—CHNH2一CHOH-CH2NH2，-CHOH—CH2NH2等基团的物质，甚至过量的铵盐也干扰本实验。

2．Salkowski(1888)蛋白黄色反应它是芳香族氨基酸，特别是有酪氨酸和色氨酸蛋白质所特有的呈色反应。

苯丙氨酸和苯反应很困难。

皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸变黄，原因在此。

硝基苯衍生物呈黄色，在碱性溶液中，它进一步形成深橙色的硝醌酸钠。

参考反应是：3．茚三酮反应蛋白质、多糖和各种氨基酸具有茚三酮反应。

除无α—氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色外．其他氨基酸生成紫红色．最终为蓝色化合物。

三、器材与试剂㈠器材⒈试管及试管架⒉水浴锅⒊量筒⒋滴管⒌滤纸片⒍移液管㈡试剂和材料⒈10％NaOH溶液⒉1％CuSO4溶液⒊0.5％苯酚溶液⒋浓HNO3⒌卵清蛋白溶液（蛋清：水＝1︰20）⒍尿素⒎0.1％茚三酮乙醇溶液四、操作步骤1.双缩脲反应（1）取一支干燥的试管，加入少量尿素，用微火加热使尿素熔化，待融化的尿素重又开始硬化时停止加热，此时尿素已缩合成双缩脲并放出氨（可由其嗅味辨别或见红色石蕊试纸变色）。

试管冷却后，加入约1毫升10％氢氧化钠溶液，振荡使双缩脲溶解，再加入2滴1％硫酸铜溶液，混匀后观察有无紫色出现。

（2）另取一支试管，加卵清蛋白溶液10滴，再加10％NaOH溶液10滴及1％CuSO4溶液2滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。

2. Salkowski(1888)蛋白黄色反应（1）取一支试管，加入卵清蛋白溶液10滴及浓HNO33－4滴，加热，冷却后再加入10％NaOH溶液5滴，观察颜色变化。

（2）取一支试管，用0.5％苯酚溶液代替蛋白质溶液，重复上述操作，注意黄色的生成及最后变成橙色。

（3）剪一些指甲和头发分别放入2支试管中，各加入数滴浓硝酸，观察颜色的变化。

3.茚三酮反应（1）取2支试管分别加入卵清蛋白溶液和甘氨酸溶液1ml，再各加入0.5ml0.1％茚三酮－乙醇溶液，混匀，在沸水浴中加热1－2分钟，冷却，观察颜色变化，并比较蛋白质和氨基酸溶液呈色深浅。

（2）在一块滤纸片上滴加1滴0.5％甘氨酸溶液，风干后，加1滴0.1％的茚三酮－乙醇溶液显色，用电吹风吹开显色。

观察出现的紫红色斑点。

五、实验记录以“十”和“一”表明阳性、阴性反应，标明颜色并以“＋”、“＋＋”和“＋＋＋”表明颜色深浅程度。

六、思考题”1 综合分析、对比蛋白质和各种氨基酸鉴定方法的特点和用途。

2．如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反应呈阴性结果。

能对此作何结论?3．茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调?若不是。

为什么?4．是否所有的氨基酸都呈现黄色反应的阳性结果，为什么?是否大部分蛋白质呈现阳性结果。

为什么?实验二蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝染色法一、目的要求学习考马斯亮蓝(Coomssie Brilliant B1ue)法测定蛋白质浓度的原理和方法。

二、原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质—染料结合的原理浓度的快速。

灵敏的方法。

考马斯亮蓝G—250存在着两种不同的颜色形式．红色和蓝色。

它和蛋白质通过范德瓦尔键(vsn der Waals’bond)结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer’slaw)。

此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量．蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h之后，蛋白质—染料复合物发生聚合并沉淀出来。

蛋白质—染料复合物具有很高的消光系数．使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5pg 时就有0．275光吸收值的变化，比lowry法灵短4倍，测定范围为10一1000ug蛋白质，微量测定法测定范围是1—10ug蛋白质。

此反应重复性好．精确度高，线性关系好．标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重合，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低．但直线弯曲程度很轻，不影响测定。

此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgC12，乙醇，(N4H)2S04无干扰．强碱缓冲剂在测定中有一些颜色于扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响．Tris，乙酸，2—巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X—100,SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。

但是，大量去污刑的存在对颜色影响太大而不易消除。

三、试剂与器材㈠试剂1．考马斯亮蓝试剂考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50mL95％乙醇中，加入100mL 85％磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤。

最终试剂中含0.01％(W/V)考马斯亮蓝G—250，4.7％(W/V)乙醇，8.5％(W/V)磷酸。

2．标准蛋白质溶液结晶牛血清清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/L NaCl配制成1mg／mL蛋白溶液。

㈡测试样品未知蛋白质溶液。

㈢器材试管、试管架、移液管(5mL)，微量取液器，721型分光光度计四、操作方法㈠标准法制定标准曲线取14支试管．分两组按下表平行操作表8 考马斯亮蓝标准曲线制作方法绘制标准曲线：以595nm为纵坐标．标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

㈡测定未知样品蛋白质浓度测定方法同上，通过一定的稀释方法，取合适的未知样品体积。

使其测定值在标准曲线的直线范围内。

根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）。

五、注意事项(1)如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5—20min血内测定光吸收，因为在这段时间内颜色最稳定。

(2)测定中，蛋白—染料复合物会有少部分吸附于比色皿壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的，测定完后可用乙醇将蓝色的比色皿洗干净。

六、思考题1.如果给定的蛋白质溶液浓度不在标准曲线的范围内，你应当采取什么的措施使其适用于考马斯亮蓝染色测定法?2.测定蛋白质溶液浓度的方法还有哪些？请列出三种以上。

实验三脂肪的定量测定——索氏（Soxhlet）提取法一、目的和要求1.学习和掌握粗脂肪提取的原理和测定方法。

2.熟悉和掌握重量分析的基本操作，包括样品的处理、定量转移、烘干、恒重等。

二、原理本法为重量法，用脂肪溶剂将脂肪提出后进行称量。

该法适用于固体和液体样品，通常将样品浸于脂肪溶剂，如乙醚或沸点为30-60度的石油醚，借助于索氏提取管进行循环抽提。

本法提取的脂溶性物质为脂肪类似物的混合物，其中含有脂肪，游离脂肪酸，磷脂，酯，固醇，芳香油，某些色素及有机酸等，因此，称为粗脂肪。

用该法测定样品含油量时，通常采用沸点低于60度的有机溶剂，此时，样品中结合状态的脂类（脂蛋白）不能直接提取出来，所以该法又称为游离脂类定量测定法。

脂肪类化合物一般都溶于有机溶剂（如乙醚、石油醚）而不溶于水或微溶于水，利用此特性，可以用索氏脂肪提取器抽提出样品中的脂肪。

索氏脂肪提取器——索氏（Ｓｏｘｈｌｅｔ）脂肪提取器为一回馏装置,由浸提管、小烧瓶及冷凝管三者联接而成，浸提管两侧分别有虹吸管及通气管。

盛有样品的滤纸包放在浸提管内，溶剂乙醚（或石油醚）盛于小烧瓶中，加热后，溶剂蒸汽经通气管至冷凝管，冷凝的溶剂滴入浸提管，浸提样品。

浸提管内溶剂愈积愈多，当液面达到一定高度，溶剂及溶于溶剂中脂肪类物质经虹吸管流入小烧瓶。

小烧瓶的溶剂由于受热而汽化，气体至冷凝管而滴入浸提管内，如此反复提取回馏，将样品中脂肪类物质提尽并瓶的增重，就是样品中所含脂肪的量。

带到小烧瓶中。

最后将小烧瓶中的溶剂蒸去，烘干，小烧瓶称重。

因本法提取的物质，除中性脂肪外，还会有游离脂肪酸、蜡、磷脂、固醇及色素等脂溶性物质，故提出的物质只能称粗脂肪。

三、步骤样品的准备将样品在80度烘箱内烘去水分，烘干时需避免过热，冷却后准确地称取1克左右放入研钵中研碎，再用滤纸将样品包裹好放入索氏提取管内。

注意勿使纸包内样品高于提取管的虹吸部分，研磨后的研钵应用滤纸擦净并将滤纸放入提取管内，用少量溶剂洗涤研钵，将溶剂倒入提取管中。

1.抽提洗净提取瓶于105℃烘干至恒重，冷却后准确称重，并记录瓶重。

装入石油醚达提取瓶容积的一半，连接提取器各部分，不能漏气（不能用凡士林或真空脂）。

2.加热提取精密称取待测样品2g（A），用滤纸包好，放入浸提管内，纸包长度不能超过虹吸管高度。

于已称重的小烧瓶内倒入1/2-1/3体积的石油醚（其量应略大于浸提管内体积），联接索取器各部分（不能涂凡士林）。

置约70℃恒温水浴锅内（水必须是蒸馏水或置于电热板上）控制加热温度，使每小时回馏3－5次较宜，一般提取10小时左右。

4.称重提取完毕，待石油醚完全流入小烧瓶时取滤纸包，再回馏一次以洗涤浸提管。

继续加热，待浸提管内石油醚面接近虹吸管上端而末流小烧瓶前，倒出浸提管中的石油醚，如果小烧瓶中尚留石油醚，则继续加热蒸发，直至小烧瓶中溶剂基本蒸完。

停止加热，取下小烧瓶，用吹风机在通风橱中将瓶中残留石油醚吹尽。

再置103－105℃烘箱中烘半小时，取出冷却后立即称重。

将提取瓶中的石油醚全部蒸干，洗净外壁，置于105℃烘箱中干燥至恒重，再把瓶中脂肪倒出，洗净，烘干，并恒重称重，然后按下式计算粗脂肪百分含量。

粗脂肪（100％）＝样品重量（克）量（克）量（克）－提取瓶的重提取瓶及瓶中脂肪的重×100％也可以按照下式较简易的计算粗脂肪（100％）＝纸包的重量－烘干纸包的重量×100％芝麻的重量四、器材与试剂1.器材：天平，索氏脂肪提取管，恒温水浴锅，滤纸。

2.试剂：石油醚（30－60℃）。

五、实验报告计算所测材料中的粗脂肪含量,记录实验中发生虹细的时间,进行比较总结规律,并比较不同种类的样品的脂肪提取率,与通过从资料中查到的脂肪含量进行比较。

从中进行总结。

六、思考题1.哪些种子的粗脂肪含量较高？2.写出四、五种良好的脂肪溶剂.3.查阅生化类教科书，写出几种脂溶性维生素。