在有机介质中酶法合成小肽的研究进展张学忠①(吉林大学酶工程实验室　长春130023)提要:就利用蛋白酶在有机介质中合成小肽研究所涉及的几个关键问题以及方法学上的研究进展情况作了讨论和评述,目的在于探讨如何构建一个理想的肽键合成体系。

一、引 言 近20年来,随着非水酶学研究的深入与发展,酶在有机合成中的应用已日趋成熟,酶促合成法较化学合成法显示了许多优越性。

在有机介质中酶促肽键的合成,其中包括较大肽段间的缩合,尤其是合成只含几个氨基酸的小肽片段,较传统的化学合成法占有明显的优势。

它的主要优点表现在反应条件温和,立体专一性强,不用侧链保护基和几无副反应等。

最近几年,利用各种来源的蛋白水解酶,在非水介质中合成了各种功能短肽或其前体,其中包括一些具有营养功能的二肽和三肽,低热量高甜度的甜味剂二肽以及具有镇静作用的脑啡肽五肽等。

利用酶反应器,连续合成某些功能短肽已接近生产规模[1]。

目前,国际上,酶法合成疏水二肽的最高收率已接近100%。

然而,在有些情况下,一些天然的或人工设计的具有特定生理功能的短肽含有亲水性的氨基酸残基或D2型氨基酸残基。

由于亲水氨基酸在疏水性有机溶剂中几乎不溶,以及大多数蛋白酶仅能利用L2型氨基酸,因而用酶法合成含亲水性氨基酸或D2型氨基酸残基的短肽,在方法学上需要有所突破。

近年来,国际上都在致力于方法学的改进,本文将就利用蛋白水解酶在有机介质中合成短肽的研究所涉及的几个关键性问题进行讨论,目的在于说明如何构建一个理想的反应体系,从而提高肽产物的收率。

二、方法原理 K libanov[2]对在有机介质中酶促有机合成的原理进行过详细的讨论。

对于肽合成来说,肽键的生成反应可以用下式表示:A+BKC+D(1)(1)式中C代表产物,即肽,D代表水。

在反应达到平衡时,有[C]=K[A][B] [D](2)(2)式中K为平衡常数。

由(2)式可知,通过从平衡中移去产物D,可以使平衡向生成产物的方向移动。

另外,通过改变有效平衡常数,也可以使反应向生成产物C的方向移动。

假定(1)式在水中反应的平衡常数为Kw,那么,在水2有机溶剂双相体系中,有效平衡常数K与Kw的关系有下面形式[3]:K=Kw(1+Α・P c)(1+Α・P d)(1+Α・P a)(1+Α・P b)(3) (3)式中Α为有机相对水相的体积比,P a,P b, P c和P d为相应组分在有机相和水相间的分配系数。

假如A和B在有机相中的溶解度小,例如,P a≈P b≈100,又假定Α≈100,那么,由(3)式可知K>2500Kw。

因此,在有机双相体系中的平衡常数要比在水中的平衡常数大三个数量级。

在有蛋白酶存在时,生成肽键的反应可以加速达到平衡。

这是在有机介质中酶促合成肽键的理论依据。

利用蛋白水解酶,在有机介质中合成小肽的一个关键问题是在实践中如何提高肽产物的收率。

目前,比较有效的方法—55—①男,1942年生,大学,教授;研究方向:极端环境酶催化;联系人。

是采取热力学控制的肽键生成,即平衡合成:或者采取动力学控制的肽键生成,即非平衡合成。

热力学控制的肽键生成,关键在于通过控制某些影响化学平衡的因素,如有机辅助溶剂,温度以及不溶性产物等,使平衡向生成肽键方向移动。

动力学控制的肽键生成有下面两种方式: 11z-AA1OM e+AA2-N H2E z-AA1 -AA2-N H2(4) 21z-AA1OM e+AA2E z-AA1-AA2 +M eOH(5) (4)和(5)式中AA是氨基酸(Am ino A cid)缩写,z代表氨基酸N端上的保护基,M e代表羧端的酯基,AA-N H2表示一种氨基酸酰胺。

在上述两种方式下,N2保护的氨基酸酯可以快速形成一种活化的酰胺2酶中间体,然后与亲核试剂氨基酸酰胺或自由氨基酸进行转酯化反应。

转酯化反应是很快的,产物转化率在几十分钟内就可以达到极大值。

然而,热力学控制的肽合成通常需要几十个小时。

三、酶的稳定化 酶反应由传统的水相过渡到有机相,必须考虑的一个问题是酶的稳定性。

其中反应体系的水含量是影响酶稳定性的重要因素之一。

在有机溶剂中,随着水含量的增加,酶的稳定性将减弱。

此外,溶剂的极性是影响酶稳定性的另一重要因素。

一般来说,疏水性强的有机溶剂有利于酶的稳定性。

有一点应该指出,由于目标产物的不同,采用的有机溶剂系统也应该有所不同,因而也应采取相应使酶稳定化的措施。

当采用与水互溶的有机溶剂(丙酮,乙腈,二恶烷,二甲亚砜,二甲替甲酰胺,甲醇和乙醇等)系统时,加入适当浓度的与水互溶的某些化合物,有利于增加酶的稳定性,例如,甘油和一些多元醇等,它们的作用可以减少水的活度[4]。

当采用水2水不互溶有机溶剂(氯仿,酯,脂肪醇和烃类)双相体系时,酶对各种有机溶剂的敏感程度差别也是很大的。

一般来说,也是极性弱的有机溶剂对酶的稳定性要比极性强的有利。

使酶在水2有机溶剂双相体系中稳定化的措施之一是使用固定化酶。

一般来说,只要酶保持在水相中,避免暴露到水相和有机溶剂间的界面,可以预期有很好的稳定性。

载体与有机溶剂间极性差越大,酶在界面暴露的危险性就越小。

我们[5]利用木瓜蛋白酶合成模型化合物Boc2Phe2V al OM e二肽时。

为了考察固定化载体对该酶催化性质的直接影响,使用了四种固定化载体(硅藻土,C M—纤维素,QA E—葡聚糖凝胶A—25和自制的鸡卵清蛋白),并用不同的方法(简单吸附,离子交换吸附,共价交联)将木瓜蛋白酶固定。

通过研究水含量, pH,离子强度和反应温度等因素与产物二肽收率的关系,我们发现自制的鸡卵清蛋白载体给出最好的结果。

二肽产率达9415%。

通过简单吸附法制备的硅藻土固定化木瓜蛋白酶也给出较好的结果。

在小肽合成中,有时采用水含量极低的有机溶剂体系。

在水含量很低时,酶分子构象很难发生变化,这类似于酶的固定化。

四、合成小肽最佳反应体系的构建 11溶剂系统的选择前面已经提到反应介质对酶活性的影响很大。

尽管很难比较酶在有机溶剂中和在水溶液中的活性,但研究表明,在有机溶剂中酶反应速度差不多和在水溶液中有相同的数量级。

在极性的,无水的有机溶剂,如甲酰胺,二甲酰胺或二甲亚砜中,Α2胰凝乳蛋白酶经历大的构象变化而失去活性。

L aane等[6]研究了一百多种有机溶剂的疏水性与酶活力之间的关系并使用一个参数L ogP作为衡量指标。

L ogP表示一种有机溶剂在正辛醇2水两相溶液中的分配系数的对数。

L ogP值既可以从实验上测得,也可以由Pekker疏水片段常数计算。

他们发现当L ogP>4时,反应介质有利于酶活性,是理想的介质。

而当L ogP<2时,有机溶剂极性太强,易剥夺酶分子表面的必需水层,不适合作为酶—65—促反应的介质。

2<L ogP<4的有机溶剂是中等反应介质。

R eslow等[7]在研究N2乙酰2苯丙氨酸与乙醇转酯化反应时也发现,在L ogP值高,即疏水性强的有机溶剂中,吸附在多孔的玻璃珠上的Α2胰凝乳蛋白酶显示了较高的活性,而且操作稳定性也比疏水性小的有机溶剂系统好。

在选择有机溶剂时,也必须考虑到氨基酸底物的极性问题,亲水性的氨基酸底物在大多数常采用的疏水性有机溶剂中溶解度很低,这一问题稍后还将专门讨论。

最近,Kuh l 等[8]做了大胆的尝试,不使用任何有机溶剂,在微水条件下研究了嗜热菌蛋白酶催化Z2phe2 L eu2N H2合成,二肽收率达到87%。

21反应体系中水含量最适含水量的控制要考虑下述因素:酶的性质,固定化载体的性质,溶剂的性质以及底物的极性等。

测量反应体系中水有效性的一个热力学参数是水的活度Aw[9],它影响反应初速度和最大反应速度。

通常,减小水的活度,有利于肽键的生成。

N o ritom i等[10]利用Α2胰凝乳蛋白酶在含少量水的乙腈中由N2乙酰基2L2酪氨酸和氨基酸酰胺合成含酪氨酸的各种二肽时,发现超过最适水含量,明显有利于肽键水解。

我们[5]先前曾报道过,利用木瓜蛋白酶在乙酸乙酯中合成二肽Boc2Phe2L euOM e时,当反应体系水含量为115%时,产物肽的最佳收率为92%。

31pH和离子强度酶的微环境对于酶活性的表达是至关重要的。

酶解离基团的解离状态应该是最佳的。

Za2 ke和K libanov[11]曾发现脂肪酶催化的三丁酸甘油脂与正庚醇之间的转脂化反应的反应速度与酶粉冻干前所在溶液的pH有密切的关系。

他们认为这是由于在有机溶剂中不能发生质子化和去质子化,因而当酶分子从水溶液中向有机溶剂中转移时,保留了原有的离子化状态,即水溶液的pH在有机溶液中被保留下来,有时把这种现象称为酶的“记忆”功能。

最近,Yen2 naw ar等[12]对酶这种记忆功能从结构上作了解释。

此外,酶在有机溶剂中的活力不仅与酶冻干前水溶液的pH有关,而且与缓冲液的离子强度有关。

如果使用固定化酶的话,反应体系离子强度的选择应考虑到载体的带电性质。

我们[5]在利用固定化木瓜蛋白酶合成各种二肽时发现,不带电荷的载体需要较低的离子强度,可获得最佳的二肽收率,而带电荷的载体刚好相反。

此外,在固定化酶冻干之前,通过加入底物类似物,使酶发挥最佳功能状态的构象被“锁住”,可以达到增加酶活性的目的。

Stab l[13]曾报道,在冻干Α2胰凝乳蛋白酶时,如果有D2型氨基酶底物存在时,在无水环已烷溶剂中,酶可以接受D2型氨基酸底物。

41反应温度酶在有机溶剂中催化肽健合成与水相反应一样,反应速度与温度相关。

提高反应温度,通常会增加酶反应速度。

但是,温度过高会引起酶的变性失活。

而且,提高反应温度虽然能加快反应速度,但不能保障一定就提高肽产物的收率。

最近的一些研究报道表明,在低温下的肽键酶促合成,可以大大提高肽产物的收率。

M attiasson等[14]研究了亚零度条件下,利用Α2胰凝乳蛋白酶合成N2乙酰2L2酪氨酰2L2丙氨酰胺的反应,发现在222℃或235℃,产物的转化率几乎达到100%。

在低温条件下进行酶催化,可以控制水的活度,从而抑制了水解反应,有利于肽键的生成。

五、底物的溶解性和D2型氨基酸的利用 在有机溶剂中酶促合成肽键常常遇到氨基酸底物的溶解性问题。

它涉及两个方面,一是氨基酸底物本身的极性,二是有机溶剂的极性。

在实践中最常遇到的难题是如何解决亲水性氨基酸底物在非极性有机溶剂中的溶解性问题。

往体系中加水固然可以增加亲水性氨基酸底物的溶解度,但也会使化学平衡向水解反应方向移动。

到目前为止,尽管没有很好的办法解决这一问题,但有些作者也做过各种尝试。

K i m u2 ra等[15]报道,利用赖氨酸已酯和亮氨酸酰胺转—75—酯化生成亮氨酰2亮氨酸酰胺二肽的转酯化反应,同时通过使用一种阳离子交换树酯增加底物与产物的选择性吸附,使二肽产物收率达到72%。