摘要............................................................................. .. (4)【实验过程】 (5)PartⅠ. NDV 抗血清制备 (5)一、实验原理 (5)二、实验仪器、材料和试剂 (7)1. 仪器 (7)2. 材料 (7)3. 试剂 (7)三、方法和步骤 (7)（一）NDV 兔抗血清制备 (7)1. 家兔捉拿方法 (7)2. 家兔固定方法 (8)3. 初次免疫 (9)4. 二次免疫 (10)5. 终末免疫 (10)6. 试血 (10)7. 颈动脉放血 (10)8. 血清分离 (12)9. 抗血清保存 (12)（二）NDV 鼠抗血清制备 (12)1. 小白鼠的捉拿和固定 (12)2. 初次免疫 (13)3. 二次免疫 (15)4. 终末免疫 (15)5. 试血 (16)6．放血 (18)7．血清分离 (19)8．抗血清保存 (19)Part Ⅱ. 琼脂双扩散实验检测抗体效价 (19)一、基本原理 (19)二、实验仪器、材料和试剂 (20)1. 仪器 (20)2. 材料 (20)3. 试剂 (20)三、方法和步骤 (20)1. 灭活鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株抗原提取 . 202. 1%琼脂糖配制 (20)3. 倒平板 (21)4. 打孔 (21)5. 稀释抗血清 (22)6. 加样 (22)7. 孵育 (23)8. 结果观察 (23)Part Ⅲ. 酶联免疫吸附试验测定 NDV 抗血清效价 (23)一、基本原理 (23)二、实验仪器、材料和试剂 (24)1. 仪器 (24)2. 材料 (24)3. 试剂 (24)三、方法和步骤 (25)1. 鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活抗原提取 . 252、抗原包被 (25)3. 封闭 (25)4. 洗板 (25)5. 稀释抗血清 (25)6. 加抗血清 (26)7. 洗板 (26)8. 加酶标二抗 (26)9. 洗板 (27)10. 显色 (27)11. 终止 (27)12. 读数 (27)13. 结果判定 (27)Part Ⅳ. 免疫印迹实验鉴定抗体的特异性 (27)一、基本原理 (27)二、实验仪器、材料和试剂 (28)1. 仪器 (28)2. 材料 (28)3. 试剂 (28)（1）SDS-PAGE 相关试剂： (28)（2）Western blotting 相关试剂： (29)三、方法和步骤 (30)1. SDS-PAGE (30)2. 转膜 (31)3. 免疫检测 (33)（1）膜的封闭 (33)（2）洗膜 (33)（3）加入一抗 (33)（4）洗膜 (33)（5）与二级抗体作用： (33)（6）洗膜 (33)（7）Odessey 近红外成像仪扫描成像 (34)【实验结果及分析】 (34)NDV 抗血清制备及抗体效价测定摘要：抗血清，新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。
在病毒分类学中的位置属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒属（Paramyxovirus）中的一个种。
该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。
以新城疫病毒灭活疫苗（Ulster 2C 株）灭活油剂苗多种途径免疫兔和小白鼠，制备新城疫病毒抗血清。
也叫免疫血清，是指含有免疫蛋白的血清。
抗体效价指抗体的物理状态及其在体内滞留时间，以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果。
此次实验主要是进行家兔与小鼠的新城疫病毒抗血清的制备过程，并通过酶免疫吸附试验、兔疫印迹实验对其进行抗体效价检测。
关键字：NDV 抗血清抗体效价免疫【实验过程】本次实验一共分为四个大步骤：PartⅠ. NDV 抗血清制备一、实验原理将具有免疫原性的物质注入健康动物体内后，抗原可刺激机体相应 B 细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。
待动物血清中存在大量抗体时，采集动物血液，分离析出血清，便得到所需的抗血清（免疫血清或抗体）。
由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫血清中实际上是含有多种抗体的混合物，所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体（Polyclonal antibody，PcAb）。
多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为了获得特异性强，效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。
对于免疫原性较弱的可溶性抗原(如蛋白质类抗原)要加入佐剂，以增强免疫性。
本实验介绍新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）抗血清的制备过程。
新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。
在病毒分类学中的位置属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒属（Paramyxovirus）中的一个种。
该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。
以新城疫病毒灭活疫苗（Ulster 2C 株）灭活油剂苗多种途径免疫兔和小白鼠，制备新城疫病毒抗血清。
二、实验仪器、材料和试剂1. 仪器5mL 无菌冻存管，2.5mL 和 1mL 注射器，塑料静脉插管，碘酒，75％酒精棉球，剪刀，止血钳，250mL 无菌三角瓶，50mL 无菌尖底离心管，家兔固定槽，家兔解剖台，棉线，5mL吸头和移液器，温箱，离心机。
2. 材料家兔：1-2kg 清洁级雄性或未孕雌免；小鼠：SPF 级 6-8 周龄昆明鼠。
3. 试剂鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗（南京梅里亚动物保健公司），0.01M PBS（ pH7.2）（8 g NaCl，0.2 g KCl，2.9 g Na2HPO4.12H2O，0.2 g KH2PO4，以NaOH 调节 pH 至 7.2，加双蒸水至 1000 mL），麻醉剂：普鲁卡因溶液，硫柳汞。
三、方法和步骤（一）NDV 兔抗血清制备1. 家兔捉拿方法动物的捉拿和固定是进行动物实验的基本操作之一，正确的抓取固定动物是为了不损害动物健康，不影响观察指标，并防止被动物咬伤，保证实验顺利进行。
家兔习性温顺，除脚爪锐利应避免被其抓伤外，较易捕捉。
拿时切忌以手提抓兔耳、拖拉四肢或提拿腰背部。
正确的方法是用右手抓住其颈背部皮毛，轻提动物，再以左手托住其臀部，使兔的体重主要落在左手掌心（如图 1）。
图 1. 家兔的捉拿方法2. 家兔固定方法家兔的固定，依不同的实验需要，常用兔固定箱或兔手术台固定。
兔固定箱通常由木头、铁皮或者树脂材料制成，便于拆卸清洗消毒，一般用于固定兔子狐狸貉子等。
使用时时可将家兔置于兔固定箱内，在不需要帮手的情况下单人即可对兔子等动物打耳号，灌药、耳缘静脉注射、取血、或观察耳部血管的变化等，常用于生理、药理和免疫等作动物整体实验时限制实验物的活动。
（如图2）图 2. 家兔固定箱固定方法在需要观察血压、呼吸和进行颈、胸、腹部手术时，应将家兔以仰卧位固定于兔手术台上。
固定方法是：先以四条 1cm 宽的布带作成活的圈套，分别套在家兔的四肢腕或踝关节上方，抽紧布带的长头，将兔仰卧位放在兔手术台上，再将头部用兔头固定器固定，然后将两前肢放平直，把两前肢的系带从背部交叉穿过，使对侧的布带压住本侧的前肢，将四肢分别系在兔手术台的木柱上。
（如图3）图 3. 家兔手术台固定方法3. 初次免疫在家兔足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等部位，选择 6~10 处免疫接种点，采用皮下、皮内或肌肉注射，每点注射上述鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗 0.1～0.2mL。
如果使用没有加佐剂的灭活新城疫病毒 Ulster 2C 株，也可以采用耳缘静脉注射的方法进行免疫。
（如图4）图 4. 家兔耳缘静脉注射方法4. 二次免疫第一次免疫后间隔2周再以鸡新城疫病毒Ulster 2C株灭活疫苗采用与初次免疫相同的方法在家兔足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等部位，选择 6~10 处免疫接种点，采用皮下、皮内或肌肉注射加强免疫。
5. 终末免疫第二次免疫后间隔 2 周再按上述二次免疫方法进行第三次免疫。
6. 试血终末免疫免疫 7 天后经兔耳缘静脉采血 2mL，分离血清，用琼脂双向扩散实验测定抗体效价达 1:16 以上（稀释抗体）以上时，即可放血，如效价不高，则加强免疫 l 次后，再行检测。
7. 颈动脉放血将免疫家兔仰面固定于家兔手术台上，头部放低，暴露颈部。
沿气管钝性分离皮下组织，暴露气管前的胸锁乳突肌；分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，在肌束下面靠近气管两侧，可见淡红色搏动的颈动脉。
（如图5）图 5. 兔颈部血管神经分布图将双侧动脉仔细分离，于每侧动脉分别套入两根棉线，一根在远心端，一根在近心端，（图 6）。
图 6. 兔颈部动脉血管先将一侧动脉远心端丝线结扎紧，然后在近心端用止血钳夹住（止血钳头部用细塑料管包裹，避免损伤动脉）。
用小的尖头眼科剪在两侧丝线中间的动脉壁上剪开一个小口，以便插入塑料静脉插管（或大号钢针头），再用近心端棉线固定静脉插管，避免其从动脉内滑出；轻轻松开止血钳，血液很快沿导管流入三角瓶，直至血流缓慢点滴而出时，以同法在对侧动脉内插管放血，并将动物固定架后端抬高，增加放血量，一般一只家兔可放血80-100mL。
8. 血清分离将血液置室温中凝固约 1hr，然后置 4℃过夜，使血块收缩；用5mL 无菌移液管吸取上层血清，转移至 50 mL 无菌尖底离心管中。
然后将血块自容器壁分离，将血清全部倾入另一 50 mL 无菌尖底离心管，在 4℃下 2,500g 离心 10 分钟，取上清液即血清部分与前述血清混合，将混合血清 4℃1,500g 离心 10 分钟，弃沉淀收集血清。
9. 抗血清保存（1）4℃保存：将抗血清除菌后，加入 0.0l％硫柳汞或 0.1％叠氮钠，液体状态保存于普通冰箱，可以存放 3 个月到半年，效价高时，一年之内不会影响使用。
（2）低温保存：将抗血清除菌后，加入等量甘油，放在-20℃或-40℃，一般保存 5 年抗体效价不会有明显下降。
抗体切忌反复冻融，反复冻融会使抗体效价显著降低。
（二）NDV 鼠抗血清制备1. 小白鼠的捉拿和固定小白鼠较大白鼠温和，虽也要提防被其咬伤手指，但毋需戴手套捕捉。
可先用右手抓住鼠尾提起，置于鼠笼或实验台上，用左手的拇指和食指抓住小鼠两耳后颈背部皮肤，将鼠体置于左手心中，拉直后肢，以无名指及小指按住鼠尾部即可。
有经验者可直接用左手小指钩起鼠尾，迅速以拇指利食指、中指捏住其耳后项背部皮肤亦可。