NDV抗血清制备及抗体效价测定【实验目的】1. 学习抗血清制备的基本原理，掌握兔和小鼠免疫注射方法、兔颈动脉放血、小鼠眼球采血技术。

2. 学习双向琼脂扩散实验的基本原理，掌握的基本程序和结果判读方法。

3. 学习酶联免疫吸附实验（ELISA）的基本原理，掌握间接ELISA的基本程序和结果判读方法。

4. 学习免疫印迹实验的基本原理，掌握免疫印迹记实验的的基本程序和结果判读方法。

PartⅠ. NDV抗血清制备一、实验原理将具有免疫原性的物质注入健康动物体内后，抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。

待动物血清中存在大量抗体时，采集动物血液，分离析出血清，便得到所需的抗血清（免疫血清或抗体）。

由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫血清中实际上是含有多种抗体的混合物，所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体（Polyclonal antibody，PcAb）。

多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为了获得特异性强，效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。

对于免疫原性较弱的可溶性抗原(如蛋白质类抗原)要加入佐剂，以增强免疫性。

本实验介绍新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）抗血清的制备过程。

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。

在病毒分类学中的位置属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒属（Paramyxovirus）中的一个种。

该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。

以新城疫病毒灭活疫苗（Ulster 2C株）灭活油剂苗多种途径免疫兔和小白鼠，制备新城疫病毒抗血清。

二、实验仪器、材料和试剂1. 仪器5mL无菌冻存管，2.5mL和1mL注射器，塑料静脉插管，碘酒，75％酒精棉球，剪刀，止血钳，250mL无菌三角瓶，50mL无菌尖底离心管，家兔固定槽，家兔解剖台，棉线，5mL 吸头和移液器，温箱，离心机。

2. 材料家兔：1-2kg清洁级雄性或未孕雌免；小鼠：SPF级6-8周龄昆明鼠。

3. 试剂鸡新城疫病毒Ulster 2C株灭活疫苗（南京梅里亚动物保健公司），0.01M PBS（pH7.2）（8 g NaCl，0.2 g KCl，2.9 g Na2HPO4.12H2O，0.2 g KH2PO4，以NaOH调节pH至7.2，加双蒸水至1000 mL），麻醉剂：普鲁卡因溶液，硫柳汞。

三、方法和步骤（一）NDV兔抗血清制备1. 家兔捉拿方法动物的捉拿和固定是进行动物实验的基本操作之一，正确的抓取固定动物是为了不损害动物健康，不影响观察指标，并防止被动物咬伤，保证实验顺利进行。

家兔习性温顺，除脚爪锐利应避免被其抓伤外，较易捕捉。

拿时切忌以手提抓兔耳、拖拉四肢或提拿腰背部。

正确的方法是用右手抓住其颈背部皮毛，轻提动物，再以左手托住其臀部，使兔的体重主要落在左手掌心（如图1）。

图1. 家兔的捉拿方法2. 家兔固定方法家兔的固定，依不同的实验需要，常用兔固定箱或兔手术台固定。

兔固定箱通常由木头、铁皮或者树脂材料制成，便于拆卸清洗消毒，一般用于固定兔子狐狸貉子等。

使用时时可将家兔置于兔固定箱内，在不需要帮手的情况下单人即可对兔子等小动物打耳号，灌药、耳缘静脉注射、取血、或观察耳部血管的变化等，常用于生理、药理和免疫等作动物整体实验时限制实验物的活动。

图2. 家兔固定箱固定方法在需要观察血压、呼吸和进行颈、胸、腹部手术时，应将家兔以仰卧位固定于兔手术台上。

固定方法是：先以四条1cm宽的布带作成活的圈套，分别套在家兔的四肢腕或踝关节上方，抽紧布带的长头，将兔仰卧位放在兔手术台上，再将头部用兔头固定器固定，然后将两前肢放平直，把两前肢的系带从背部交叉穿过，使对侧的布带压住本侧的前肢，将四肢分别系在兔手术台的木柱上。

图3. 家兔手术台固定方法3. 初次免疫在家兔足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等部位，选择6~10处免疫接种点，采用皮下、皮内或肌肉注射，每点注射上述鸡新城疫病毒Ulster 2C株灭活疫苗0.1～0.2mL。

如果使用没有加佐剂的灭活新城疫病毒Ulster 2C株，也可以采用耳缘静脉注射的方法进行免疫。

图4. 家兔耳缘静脉注射方法4. 二次免疫第一次免疫后间隔2周再以鸡新城疫病毒Ulster 2C株灭活疫苗采用与初次免疫相同的方法在家兔足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等部位，选择6~10处免疫接种点，采用皮下、皮内或肌肉注射加强免疫。

5. 终末免疫第二次免疫后间隔2周再按上述二次免疫方法进行第三次免疫。

6. 试血终末免疫免疫7天后经兔耳缘静脉采血2mL，分离血清，用琼脂双向扩散实验测定抗体效价达1:16以上（稀释抗体）以上时，即可放血，如效价不高，则加强免疫l次后，再行检测。

7. 颈动脉放血将免疫家兔仰面固定于家兔手术台上，头部放低，暴露颈部；沿颈部中线用2％普鲁卡因溶液局部麻醉，15分钟后剪开颈中部皮肤10cm长。

沿气管钝性分离皮下组织，暴露气管前的胸锁乳突肌；分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，在肌束下面靠近气管两侧，可见淡红色搏动的颈动脉。

图5. 兔颈部血管神经分布图将双侧动脉仔细分离，于每侧动脉分别套入两根棉线，一根在远心端，一根在近心端，（图6）。

图6. 兔颈部动脉血管腹腔内注射肾上腺素1mg，以升高血压，加快心率，避免因放血后血压降低造成凝集而影响取血量；先将一侧动脉远心端丝线结扎紧，然后在近心端用止血钳夹住（止血钳头部用细塑料管包裹，避免损伤动脉）。

用小的尖头眼科剪在两侧丝线中间的动脉壁上剪开一个小口，以便插入塑料静脉插管（或大号钢针头），再用近心端棉线固定静脉插管，避免其从动脉内滑出；轻轻松开止血钳，血液很快沿导管流入三角瓶，直至血流缓慢点滴而出时，以同法在对侧动脉内插管放血，并将动物固定架后端抬高，增加放血量，一般一只家兔可放血80-100mL。

（4）8. 血清分离将血液置室温中凝固约1hr，然后置4℃过夜，使血块收缩；用5mL无菌移液管吸取上层血清，转移至50 mL无菌尖底离心管中。

然后将血块自容器壁分离，将血清全部倾入另一50 mL无菌尖底离心管，在4℃下2,500g离心10分钟，取上清液即血清部分与前述血清混合，将混合血清4℃1,500g离心10分钟，弃沉淀收集血清。

9. 抗血清保存（1）4℃保存：将抗血清除菌后，加入0.0l％硫柳汞或0.1％叠氮钠，液体状态保存于普通冰箱，可以存放3个月到半年，效价高时，一年之内不会影响使用。

（2）低温保存：将抗血清除菌后，加入等量甘油，放在-20℃或-40℃，一般保存5年抗体效价不会有明显下降。

抗体切忌反复冻融，反复冻融会使抗体效价显著降低。

（二）NDV鼠抗血清制备1. 小白鼠的捉拿和固定小白鼠较大白鼠温和，虽也要提防被其咬伤手指，但毋需戴手套捕捉。

可先用右手抓住鼠尾提起，置于鼠笼或实验台上，用左手的拇指和食指抓住小鼠两耳后颈背部皮肤，将鼠体置于左手心中，拉直后肢，以无名指及小指按住鼠尾部即可。

有经验者可直接用左手小指钩起鼠尾，迅速以拇指利食指、中指捏住其耳后项背部皮肤亦可。

如操作时间较长，也可固定于小白鼠固定板上。

图7. 小白鼠的捉拿和固定2. 初次免疫分别在昆明鼠背部采用肌内、皮下或皮内注射鸡新城疫病毒Ulster 2C株灭活疫苗0.2mL，或者腹腔注射鸡新城疫病毒Ulster 2C株灭活疫苗0.2mL。

（1）腹腔注射法：小鼠固定后，使腹部朝上，颈部拉直，右手持注射器（5～6号针头），从耻骨联合上一侧向头端以30度角刺入腹腔（应避开膀胱）。

可先刺入皮下2～3mm，再刺入腹腔，以防药液外漏。

针头刺入部位不宜太高太深，以免刺破内脏。

注射量一般为0.1～0.25mL/10g鼠重。

图8. 小鼠腹腔注射法（2）皮下注射法：一般两人合作。

一人左手抓住小鼠头部皮肤，右手拉住鼠尾；另一人左手提高背部皮肤，右手持住注射器（针头号同上），将针头刺入提起的皮下。

若一人操作，左手小指和手掌夹住鼠尾，拇指和食指提起背部皮肤，右手持注射器给药。

一般用量为0.05～0.25mL/10g鼠重。

图9. 小鼠皮下注射法（3）肌肉注射法：两人合作时，一人抓鼠方法同上，另一人左手拉直一侧后肢，右手持注射器，注射部位多选后腿上部外侧（针头号同上）。

如一人操作，抓鼠方法类似腹腔注射，只是药液注射在肌肉内，每腿的注射量不宜超过0.1mL。

（4）尾静脉注射法：将小鼠置于待置的固定筒内，使鼠尾外露，并用酒精或二甲苯棉球涂擦，或插入40℃～50℃温水中浸泡片刻，使尾部血管扩张。

左手拉尾，选择扩张最明显的血管；右手持注射器（4～5号针头），将针头刺入血管，缓慢给药。

如推注有阻力而且局部变白，说明针头不在血管内，应重新插入。

穿刺时宜从近为尖部1/3处静脉开始，以便重复向上移位注射。

一般用药量为0.1～0.2ml/10g，不宜超过0.5ml/10g。

图10. 鼠尾皮下注射法3. 二次免疫第一次免疫后间隔2周分别在昆明鼠背部采用肌内、皮下或皮内注射鸡新城疫病毒Ulster 2C株灭活疫苗0.2mL，或者腹腔注射鸡新城疫病毒Ulster 2C株灭活疫苗0.2mL。

4. 终末免疫第二次免疫后间隔2周分别在昆明鼠背部采用肌内、皮下或皮内注射鸡新城疫病毒Ulster 2C株灭活疫苗0.2mL，或者腹腔注射鸡新城疫病毒Ulster 2C株灭活疫苗0.2mL。

5. 试血末次注射7天后鼠眼球采血0.2mL，分离血清，用琼脂双向扩散实验测定抗体效价达1:16以上（稀释抗体），即可放血，如效价不高，继续加大剂量，加强l-2次后，常可使效价增高。

鼠眼球采血可采用以下两种方法：（1）眼眶后静脉丛采血：用7~10cm长的玻璃取血管，其一端内径为1—1.5 mm，另一端逐渐扩大，细端长约1cm即可，将其尖端折断，使其锋利。

将取血管浸入1%肝素或其它抗凝剂溶液处理，干燥后使用。

采血时，右手提免疫后昆明鼠鼠尾，鼠头朝下将鼠旋转离心甩动1min，左手拇指和食指抓住鼠两耳之间的皮肤使鼠固定，并用中指配合，轻轻压迫颈部两侧，阻碍静脉回流，使眼球充分外突，提示眼眶后静脉丛充血。

取用肝素过的医用毛细采血管，右手拇指、食指和中指握住毛细管，将其尖端插入内眼角与眼球之间，轻轻向眼底方向刺入约2~3mm，手指旋转捻动毛细管以刺破静脉丛，鼠血顺毛细管流入1.5mL无菌离心管中，收集鼠血。

采血结束后，拔出取血管，放松左手，出血即停止。

用本法短期内可重复采血。