2．丙酮及醇类固定剂
• 系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其 作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性 很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇 类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白 质保存效果较差，解决的办法是和其它 试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯 仿、甲醛等。
（1）ke氏改良剂（100%酒精95ml，
2.各种因素对组织标本的取材的影响
• 如各种内窥镜钳取的组织，常因过度挤压
而变形，严重者组织结构被破坏。大组织标本
病变分布广泛，抗原在组织中分布不均一，常
出现人为的组织取材不准确。为了避免上述缺 点，组织取材时应注意：①活检钳的刃口必须 锋利，以免组织受挤压；②取材部位必须是主 要病变区；③必须取病灶与正常组织交界区；
2.脱水、透明、浸蜡
固定后的组织用水冲洗后，组织中 充满水分，妨碍石蜡的侵入，必须用不 同浓度的酒精将组织中的水分脱净，这 一过程称为脱水。脱水后组织中含有酒 精，仍不能与石蜡相融，要用二甲苯或 氯仿替代酒精，组织经过二甲苯后呈现 透明状态，这一过程称为透明。把透明 后的组织块投入融化的石蜡中浸润，使 组织内的空隙充满石蜡，产生一定的硬 度，这叫浸蜡。
• 丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用
于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存
抗原性较好，平时4℃低温保存备用，临
用时，只需将涂片或冰冻切片插入冷丙
酮内5-10min，取出后自然干燥，贮存于 低温冰箱备用。
2. 复合固定剂
Bouin’s液 (饱和苦味酸75ml+40%甲醛25ml+36％冰醋酸
④必要时取远距病灶区的正常组织作对照。
3.取材后的处理
• 为充分保存组织的抗原性，标本离体后应立即 作处理，或立即速冻成冻块进行冰冻切片，或立即用 固定液固定进行脱水、浸蜡、包埋、石蜡切片。如不 能迅速制片，可贮存于 -196℃液氮罐内或-80℃冰箱
内备用。
二、细胞和组织的固定
• 为了更好的保持细胞和组织原有的 形态结构，防止组织自溶，有必要对细 胞和组织进行固定。固定的作用不仅是 使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源 性和内源性酶活性，更重要的是最大限 度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶 性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原 弥散。
。
组织学切片标本制作技术简介
制作光镜组织学标本最常用的方法 是石蜡包埋切片法,即用石蜡把组织块包 起来，使组织变硬，便于切薄。其主要 步骤如下：
1.取材、固定
取材一般在动物死后2小时以内取。 将取下的新鲜的组织块迅速投入固定液 中进行固定。固定液的种类很多，常用 的有：福尔马林、酒精、丙酮及一些混 合固定液。固定的目的在于使组织中的 蛋白质迅速凝固，以停止其死亡前的变 化，从而保持标本的结构接近于其生前 的正常状态。
大家好
组织学技术与方法
组织学与胚胎学的研究技术
常用技术 [1].石蜡切片(paraffin sectioning)术 取材固定→脱水包埋→切片染色→封片 [2].冰冻切片(freezing sectioning) 取材→速冻→冰冻切片→染色→封固 [3].其他:涂片-血液、磨片-牙、铺片-CT等
冰醋酸5ml），用于冰冻切片的后固定。
（2）乙醚（或氯仿）与乙醇等量混合液。
Danos（1976）等认为其组织穿透性极 强，即使涂片上富于过多的粘液，固定 效果仍然良好，是理想的细胞固定液。
（3）AAF液：95%-100%酒精85ml，冰 醋酸5ml，40%甲醛10ml。
（4）Carnoy氏液：100%酒精60ml， 氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4℃保存 备用。 以上两种固定液适宜糖原，某些抗 原，癌基因蛋白产物检测的 固定，P53 抗癌基因蛋白产物，PC-NA等抗原的保存。
3 .包埋、切片 浸蜡后，把组织块放入装有溶化的固体石蜡的包埋器中，待 石蜡凝固后，组织块便被包埋在里面，成为蜡块，这一过程称 为包埋。把包埋好的蜡块修好，粘在木块上，便可放到切片机 上，切成 5—6μm厚的薄片，然后贴在干净的载玻片上，置于 60℃左右的温箱内烤干。 包埋器
粘好的 木块
载玻 片
4.染色、封固 贴好的切片，经过脱蜡、酒精侵水等过程后，即可进行染色。常 用的染色方法是苏木素伊红染色法（Hematoxylin Eosin stain），简称Ｈ& Ｅ染色法。苏木素是一种碱性染料，可使组织细胞中的酸性物质（ 又称嗜碱性物质）染成紫蓝色，如细胞核中的染色质等；伊红是一 种酸性染料，可使组织细胞中的碱性物质（又称嗜酸性物质）染成 红色，如多数细胞的细胞质、核仁等在H&E染色的切片中均呈红色 ，很易跟细胞核区别。另外，还有硝酸银染色、三色或多色染色等 ，在此不作介绍。染色后，经酒精脱水、二甲苯透明，即可封固。 封固时,在切片标本上滴一滴树胶，盖上盖玻片，干后即成为既可以 在镜下观察又能够长期保存的标本。
（一）、固定剂
1．醛类固定剂（单纯固定剂）双功能交联剂，其作用是使组织 之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强， 收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K链和λ链的标记 效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。 （1）10%钙-福尔马林液 （40%甲醛10ml，饱和碳酸钙水溶液90ml）。 （2）10%中性缓冲福尔马林液 （40%甲醛10ml，0.01mol/L pH7.4 PBS 90ml）。 （3）4%多聚甲醛磷酸缓冲液 (pH7.4) （多聚甲醛40g,0.1mol/L PBS液pH7.4 500ml，两者混 合加热至60℃，搅拌并滴加1n NaOH至清晰为止，冷 却后加PBS液至总量1000ml）。
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三、切片观察:
德国莱卡手动切片机
一、组织标本的取材
• 取材的先后：应根据动物死后组织结构改变的 速度的快慢而定。首先打开腹腔，取出消化管， 因为消化管在血液循环停止后，黏膜很快发生 自溶现象；其次为肝脏、脾脏等多血器官及神 经组织；再其次才是其他脏器。
• 取材的大小：切取的组织块应小而薄，大小一 般以2cm×1.5cm×0.3cm为好，但有些特殊要 求的可视情况而定。 • 取材时要注明取材时间、组织名称、固定液名 称、组织块数量，以备查。