・综述与专论・生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2006年增刊
DHPLC系统工作原理及其应用李莉 王翀 陈瑶生(华南农业大学动物科学学院,五山 510642)
摘 要: 变性高效液相色谱(DHPLC)是一种高通量筛选DNA序列变异的新技术,从该仪器设备的组成、工作原理、基本操作方法、主要技术特点等作一综述,并对其在基因组领域的应用如SNP分析、双链DNA片段分析、微卫星分析、mRNA定量分析、引物纯度检测等方面及在医学、遗传学方面的应用作了较详细的综述。关键词: DHPLC 原理 应用
WorkingPrinciplesandApplicationofDHPLCSystemLiLi WangChong ChenYaosheng(CollegeofAnimalScience,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642)
Abstract: DenaturingHighPerformanceLiquidChromatography(DHPLC)isakindofhighthroughoutnewtech2niquetodetectthemutationoftheDNAsequence.Thestructureoftheinstrument,workingPrinciples,basicmanipulatingmethodandmaintechnicalcharacteristicwerereviewed.Theapplicationsinthemedicine,geneticsandgenomedomainsuchasanalysisofSNP,thefragmentofdoublestrains,microsatellite,thequantitativemRNA,thepuredetectionoftheprime,etalwerereviewedindetail.Keywords: DHPLC Principle Application
基金项目:国家自然科学基金资助(30300249) 作者简介:李莉(19822),女,硕士研究生,专业方向:动物遗传育种与繁殖,电话:020285280277
通讯作者:王翀(19682),女,博士,副教授,主要研究方向:分子遗传学,电话:020285285703,E2mail:betty@scau.edu.cn
变性高效液相色谱(denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC)是一种新的高通量筛选DNA序列变异的新技术,这一技术最先由美国Stanford大学Oefner及Underhill等于1995年报道,美国Transgenomic公司采用该原理制造专利化仪器,专利产品为WAVEµDNA片段分析系统(WAVEµDNAfragmentanalysissystem)。1.1 仪器主要组成部分硬件部分:变性高效液相色谱仪(WAVEµ3500HT):WAVEµL27100型四元梯度溶液注入系统(含四元梯度泵),WAVEµL27250型Peltier可冷却、加热自动进样器,WAVEµL27300plus型高精度Peltier柱箱,WAVEµL27400型紫外/可见光检测器,WAVEµL2700在线去气装置:四通道,样品池(可容纳4个96孔PCR板,以便进行大规模分析筛查),WAVE
µ
Maker数据工作站系统(硬件)等。
软件部分:MicrosoftWindows
µ
NT操作系统,
HSMD27000数据工作站控制接口软件,WAVEµ
Maker核苷酸片段分析系统专用软件包。1.2 DHPLC基本原理及其应用用离子对反向高效液相色谱法:①在不变性的温度条件下,检测并分离分子量不同的双链DNA分子或分析具有长度多态性的片段,类似RFLP分析,
也可进行定量RT2PCR及微卫星不稳定性测定(MSI);②在充分变性温度条件下,可以区分单链
DNA或RNA分子,适用于寡核苷酸探针合成纯度分析和质量控制;③在部分变性的温度条件下,变异型和野生型的PCR产物经过变性复性过程,不仅分别形成同源双链,同时也错配形成异源双链,根据柱子保留时间的不同将同源双链和异源双链分离,2006年增刊李莉等:DHPLC系统工作原理及其应用从而识别变异型。根据这一原理,可进行基因突变检测、单核苷酸多态性分析(SNPs)等方面的研究。1.3 DHPLC基本操作方法在进行DHPLC检测之前应设定仪器的参数:①设定dsDNA分离柱的温度,对于部分变性的温度,导入所要检测的DNA序列,WAVE系统中的WAVEµMaker软件可根据待分析片段的DNA序列很方便地预测出柱温。另外斯坦福大学Tm计算网站(http://insertion.stanford.edu/melt.html)提供的Melt软件也可辅助温度选择,解链曲线是确定柱温的最佳参考依据,但WAVEµMaker还可提供更有用的其它信息,最为重要的是分析单一片段中存在的多个解链域。因为一般软件预测的是整个序列的平均解链温度,这只是一系列合适温度条件的中点,最适检测温度还取决于期望检出变异所在区域的局部解链温度。对于dsDNA片段大小、微卫星及mR2NA的定量分析,直接采用50℃的柱温,就是很理想的检测温度。对于RNA和Oligo的检测分析,80℃也是很合适的柱温,不需要另外找软件分析处理。②设定流动相A液和B液的组成:A液含0.1mol/L的TEAA、0.1mol/L的EDTA、0.1%的乙腈。B液含25%乙腈、0.1mol/L的TEAA、0.1mol/L的ED2TA,至于运行时A液与B液的配合比例则视检测的目的不同而有所不同。③设定紫外检测器的波长为260nm。④设定自动加样器的取样样本号、进样量等。⑤根据研究的需要,设定将运行的程序名称并存盘。⑥设定实验结果储存的文件夹、文件名等。1.4 DHPLC主要技术特点DHPLC检测技术的主要特点是:①高通量(highthroughout)检测,适合大规模的SNP筛查及微卫星分型的分析。②自动化程度高:减轻劳动强度,提高检测效率。③灵敏度及特异度均较高:与直接测序相当,检测未知的SNP可达95%以上,已有许多学者进行了DHPLC相关的方法学比较研究,均提示其敏感性和特异性可达96%～100%,明显高于常用的DGGE、CCM、CSGE、SSCP等变异检测技术[5,7,8,26,27,32],目前只有基于毛细管电泳技术发展起来的荧光单链构像多态性分析(F2SSCP)在敏感性和特异性方面能与DHPLC相媲美[12]。④所检测的DNA或RNA片段的长度变动范围广,较适合大片段DNA的筛查。⑤快速:每份样本的检测时间不超过10min,对于高通量的洗脱柱,3min便可检测一个样品。⑥相对价廉:平均每检测一份样本的费用约为10元人民币。将数份样品混合后组成样品池,成本可进一步降低。⑦检测结果以图表显示,
直观易判断。1.5 DHPLC应用1.5.1 SNP检测 在部分变性温度情况下(柱温在53～78℃之间),DHPLC可进行基因突变的检测和未知SNPs筛查。基于异源双链的形成,一个杂合子个体的PCR产物一定含有野生型和突变型两种DNA,并且两者的比例为1∶1,将PCR产物进行变性复性过程,杂交会形成同源双链和异源双链。同样,当把野生型和突变型PCR产物混合后,进行变性复性过程,杂交后也会出现4种情况(图1),它们不仅形成同源双链,同时也错配形成异源双链,异源双链由于碱基对不匹配,在部分变性的温度条件下,
就会在不匹配的碱基对处部分解链,由于单链DNA
带负电荷减少,结合力弱,因此,异源双链比同源双链先洗脱出来,根据柱子保留时间(retentiontime)的差异将同源双链和异源双链分离(图2)。据此可检测反相柱(reverse2phasecolumns)中单个碱基置换、插入或缺失杂合二倍体的片段,可检测DNA片段大小在80～1000bp范围的单碱基突变,对于未知的SNP和单个核苷酸突变,系统检测的准确率大于96%,对于已知的SNP和单个核苷酸突变,系统检测的准确率大于99.9%。对于基因突变的检测及SNP的检测也是DHPLC的最主要用途。鉴于此,中外许多研究者利用DHPLC系统进行了基因突变的研究[16,24,25,27,31,34]、未知SNPs筛查[2,6,10,23,24,33]。
图1 通过杂交形成同源和异源双链
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2006年增刊
图2 同源双链与异源双链在柱子上保留时间不同而分离1.5.2 双链DNA片段分析 在非变性温度条件下(柱温50～52℃),DHPLC主要有三个方面的应用:
①双链DNA片段的分析与纯化;②微卫星的分析;
③RT2PCR产物的定量分析。在非变性温度下,DNA双链不解开,由于PCR
产物片段大小的不同,在柱子内停留的时间也有差异,小片段的DNA分子首先被洗脱出来,通过紫外吸收光(260nm)检测,WAVE
µ
Maker核苷酸片段分
析系统专用软件包将其转换为不同的峰型,参照分子量标准,通过软件系统便可读出PCR产物的不同
图3 DHPLC系统和琼脂糖凝胶电泳对HaeⅢ酶切质粒pUC18分析图谱比较片段大小。DHPLC区分DNA片段大小的灵敏度很高,每个峰能检测到0.5ng的DNA样品,且对产物的大小分辨率可达到1%的水平,即100bp左右的DNA可分离出其相差1bp的片段,1000bp左右能分离相差10bp的片段大小,分离范围广,约50～2000bp内的片段大小均能很好分辨,图3展示了用HaeⅢ酶切质粒pUC18后的琼脂糖凝胶电泳图谱和DHPLC系统分析图谱,对于采用琼脂糖凝胶电泳不能分离较接近的片段,如257bp和267bp,DH2PLC系统能有效分离,对于所需片段可根据峰的位置用Transgenomic自动收集器对DNA片段进行纯化、回收一步完成,回收产物可用于进一步的测序或克隆等。Huber等(1995)[19]用DHPLC系统快速而精确地分析了烷基化物多个负粒子DNA片段的大小。1.5.3 微卫星分析 由于微卫星核心序列重复数的差异是形成多态性的基础,引发微卫星位点发生突变的原因主要为“滑链错配”,这将导致微卫星的等位基因之间会产生几个或十几个碱基的差异,且等位基因呈共显性,利用其等位基因片段大小的差异,便可通过DHPLC系统将其不同的基因型区分开。图4展示了用DHPLC系统和PAGE胶对微卫星PCR产物检测分析对照。Devaney和Marino
(2000)[11]利用DHPLC分析了人HUMTH01位点的