碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的分离与纯化
一、实验目的
1.掌握酶分离纯化的一般步骤及相关原理；
2.悉碱性磷酸酶的分离纯化的方法步骤。

二、实验原理
有机溶剂分级沉淀是分离蛋白质的常用方法之一。

有机溶剂能使许多
溶于水的酌生物大分子发生沉淀，其主要作用是降低水溶液的介电常数。

例如20℃时水的介电常数为80，82％的乙醇溶液的介电常数为40。

溶液的介电常数降低意味着溶质分子间异性电荷库仑引力增加，从而
使溶质的溶解度降低。

这一点可从静电学的库仑定律中得到阐明。

同时有机溶剂溶于水，对
大分子物质表面的水化膜具有破坏作用，最后使这些大分子脱水而互
相聚集析出。

沉淀不同物质所需有机溶剂的浓度不同，利用不同蛋白
质在不同浓度的有机溶剂中发生沉淀作用而达到分离。

用于生物大分子分级分离的溶剂主要是能与水互溶的有机溶剂，常用
的有乙醇、甲醇和丙酮等。

进行有机溶剂沉淀时，欲使原溶液中有机溶剂达到一定浓度，需加入
有机溶剂的浓度和体积可按下式
计算：
V－需加10 0％有机溶剂剂的体积；
V0－原溶液的体积；
S1－原溶液中有机溶剂的浓度；
S2－要求达到的有机溶剂浓度；
100－指加入的有机溶剂浓度为100％。

如所加入的有机溶剂的浓度为9 5％，上式(100一S2)项应改为(95一 S2)。

在大规模制备沉淀时，若溶剂浓度的要求不太严格时，可用简单的交
叉方法求出。

本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀桨中分离纯化碱性磷酸酶(简称AKP)。

先用低浓度醋酸钠(低渗破模作用)制备肝匀浆。

醋酸镁则有保护和稳
定AKP 的作用。

匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。

含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复
分离纯化。

根据AKP 在33％的丙酮或30％的乙醇中溶解，而在50％的
丙酮或60％的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取，可从含有AKP 的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。

用有机溶剂分离纯化酶(或蛋白质)必须注意以下几点：
(1)有机溶剂沉淀是个放热过程，所以要在低温下进行。

溶剂应预冷，
加入时要边搅拌边滴加，以避免局部浓度过高使酶蛋白变性。

(2)溶剂的pH 值最好控制在被分离物质的等电点附近，以提高被分离
物质的分离效果。

蛋白质浓度应控制在5-20 mg/m1，以防止高浓度样
品的共沉淀作用。

(3) 溶液的离子强度控制在0.05一0.1范围内。

(4)有机溶剂中有中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性，提
高分离效果。

中性盐浓度一般 0.05mo1/L 左右为好，过高影响沉淀。

三、仪器、原料与试剂
仪器
移液管、量筒、玻璃勺浆器(管)、剪刀、离心机、新华定性滤纸。

原料
新鲜兔肝
试剂
1. 0.5mol/L 醋酸镁溶液：107.25g 醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至100
0 m1。

2. 0.1mol/L 醋酸钠溶液：8.2g 醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至1000 m
1
3. 0.0lmol/L 醋酸镁一0.01mol/L 酸酸钠溶液：准确吸取20mL 0.5mo
l/L 醋酸镁溶液及100mL0.14mol/L 醋酸钠溶液，混匀后定容至1000 m 1。

4. Tris—HCl pH8.8缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷12.1g，用蒸馏水
溶解后定容至1000mL，即为0.1mol/LTrls 溶液。

取100m10.1mol/LTrl
s 溶液，加蒸馏水约780mL，再加0.1mol/L 醋酸镁溶液100m1，混匀后
用1％冰醋酸调pH 为8.8，用蒸馏水定容至l000m1。

5. 正丁醇、丙酮、95％乙醇均为分析纯试剂。

四、操作步骤
以下操作均在4~10℃进行。

1.称取新鲜兔肝2g，剪碎后，置于玻璃匀浆器中，加入
2.0mL0．01mol
/L 醋酸镁一0.01mol/L酸酸钠溶液，充分磨成匀浆后，将匀浆液转移
至离心管中，用4.0mL 上述溶液分两次冲洗匀浆管，并倒入离心管中，混匀，此为A 液。

另取1支试管，编号为A，取0.1mLA 液，加4.9mLTri
s缓冲液掖(pH 8.8)，混匀，供测酶活性用。

2.加2.0mL 正丁醇溶液于上述剩余的匀浆液中，用玻璃棒充分搅拌2mi
n 左右。

然后在室内放置20 min 后，滤纸过滤，滤液置离心管中。

3.于滤液中加人等体积冷丙酮，立即混匀后离心5min(2000 r/min)，
弃上清波，向沉淀中加入4.0mL0．5mol/L 醋酸镁溶液，用玻璃棒充分
搅拌使其溶解，同时记录悬液体积，此为B掖。

吸取0.1m1B 液，置于
编号为B 的试管中，加入4.9m1Tris 缓冲掖(PH 8.8)，供测酶活用。

4.取剩余悬液体积，并计算使乙醇终浓度为30％需要加人的95％冷乙
醇量。

按计算量加入乙醇，混匀，立即离心5min(2000r/min)，量取上
清液体积。

倒人另一离心管中，弃去沉淀。

向上清液中加入95％冷乙醇，使乙醇终浓度达60％(计算方法同前)，
混匀后立即离心5min(2500r/min)，弃上清。

向沉淀中加入4．0m1 0.0 lmol/L 醋酸镁一0.01mol/L 酸酸钠溶液，充分搅拌，使其溶解。

5.重复操作步骤4，向悬浮液中加入冷乙醇(95％)，使乙醇终浓度达3 0％，混匀后立即离心5min(20 00r/min)，计算上清液体积，倒人另
一离心管中，弃去沉淀，向上清液中加入95％
的冷乙醇，使乙醇终浓度达60％。

混匀后，立即离心 5min(2500 r/mL n)，弃上清夜，沉淀用3mL0.5mol/L 醋酸镁溶液充分溶解，记录体积，此为C 液。

吸取C 液0.2m1置于编号为c 的试管中，加入3.8m1Tris 缓
冲液(PH 8.8)，供测酶活性用。

6.向上述剩余悬液中逐滴加入冷丙酮，使丙酮终浓度达33％，混匀后
离心5min(2000r/min)，弃去沉淀。

量取上清液体积后转移至另一离心
管中，再缓缓加人冷丙酮，使丙酮终浓度达 50％，混匀后立即离心15 min(4000r/min)，弃上清液，沉淀为部分纯化的碱性磷酸酶。

向此沉
淀中加入4.0m1Tris pH8.8缓冲液，使沉淀溶解，再离心5min(2000r/m in)，将上清液倒入试管中，记录体积、弃去沉淀。

上清液即为部分纯
化的酚液，此为D 液。

吸取0．2m1D 液置于编号为D 的试管中，加入0．8m1Tris 缓冲液(pH8.8)，供测酶活性用。