RNAi实验中，我们经常用到siRNA表达载体（shRNA vector）：
shRNA表达载体除了常规载体具有的一些结构之外，最显著的特点就 是其启动序列。
shRNA表达载体的启动子：
H1和U6系列为目前shRNA表达载体最常用的启动子，这一类启动子依赖 RNA聚合酶 III （pol IIIIH1-H1-U6（双启动子）
Ambion公司
pSilencer™ 4.1-CMV
Restriction sites The same ORF with fusion partner Protective residues
⑴ 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ⑵ 产物不能形成二级结构。 ⑶ 引物长度一般在15~30碱基之间。 ⑷ G+C含量在40%~60%之间。 ⑸ 碱基要随机分布。 ⑹ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 ⑺ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑻ 引物5′端可以修饰。 ⑼ 引物3′端不可修饰。 ⑽ 引物3′端要避开密码子的第3位。
DNA polymerase
PCR的条件：
94℃ 94℃ 55℃ 72℃
5min 30s 30s 30s
30 cycle
限制性内切酶 酶切PCR产物和质粒载体
单酶切（顺序酶切） 双酶切（*共用Buffer，酶活）
纯化酶切产物
切胶回收 （1）跑胶，切胶 （2）融胶，回收目的片段 （3）紫外分光光度检测DNA浓度
●广谱表达 ●转录终止位点明确，即遇到5个连续的T终止转录
⑵ H1和U6启动子区别：
● U6 启动子比H1 效率略高，而且表达持续时间相对较长 ● H1不要求shRNA序列中sense的第一个碱基一定为“G”，任意碱基均可起始转录
载体结构 1、shRNA特定的启动序列（U6、H1等等）； 2、报告基因，最常用的为GFP/RFP系列； 3、筛选标记物，新霉素(Neomycin)，潮霉素 (Hygromycin)，嘌呤霉素(puromycin )。
文献检索
通过查阅文献，我们可以获得基因名称、来源、表达谱系等相关信息。常用 的外文数据库：
Elsevier Science数据库： 荷兰Elsevier Science公司是世界知名出版商，其出版的期刊是世界上公认的 高品位学术期刊。Elsevier Science公司提供的1,100多种全文电子期刊，是 获取科技论文全文文献的重要途径. /
现在商业化的载体上用的比较多的是新霉素和嘌呤霉素。也有一些载体同 时具有这两种抗性基因。
Invitrogen公司
pSilencer™ 2.1-U6 pSilencer™ 3.1-H1
Genscript公司
pRNA-U6.1 pRNA-U61.1 pRNA-cmv3.1
System Biosciences（SBI）
NCBI=PubMed Central (PMC) the U.S. National Institutes of Health (NIH) free digital archive of biomedical and life sciences journal literature. /pmc/
Oigo1-pGEX-4T1 Oigo2-pGEX-4T1 Oigo1-pBKT7 Oigo2-pBKT7 Oigo1-pGilda Oigo2-pGiada
Oigo1-pEGFP –C1 Oigo2-pEGFP –C1 JAK2-PET-28a JAK2-pFast-BAC
RET-pGilda y758f RET-pGilda y905f RET-pGilda y981f
少量与大量制备质粒
普通级、转染级、Endofree
●普通级(用于酶切鉴定，质粒保存，测序) ●转染级（用于细胞转染） ●Endofree （用于细胞转染）
NR2A-pSFV NR2B-pSFV NR2A-LV-GFP NR2B-LV-GFP RGL-LV-GFP TIP30-LV-GFP
PCR product:vector 3~ 10:1 At 25℃ for 2-3 hours or at 16℃ overnight Inactive T4 DNA ligase (at 70 ℃ for 10min )
感受态细胞（DH5a,TOP10,JM109等） 酶切鉴定 PCR鉴定 测序 (DNASTAR、sequncer4.2)
谢谢！
引物设计（primer 5.0、Oligo 6）
1. 化学合成法 2.基因组DNA(genomic DNA library酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)
PCR模板
●已有带有目的基因的质粒。 ●细胞或组织Total RNA 反转录的cDNA。
●按受体细胞: 原核细胞载体和真核细胞载体。
能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物(荧光蛋白，真核抗性
标记），便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单
一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA（多数质量载
体的容量小于5kb）。
pCDNA3.1 (non fusion or fusion) pCI-HA (fusion with HA tag) pRK5-FLAG (fusion with FLAG tag) pFLAG-CMV (fusion with FLAG tag) pEGFP-C1/N1 pIRES2 -EGFP
2010-3-22
Get the target DNA sequence Select appropriate vector PCR primer design Obtain cell or tissue PCR amplification Restriction, ligation and transformation Screen positive clone Sequencing
基因序列查找（http://www.ncbi.nlm.n种ih属.g名o称v/）
Rat Olig1
什么是基因载体（vector）：
是指将外源DNA或基因携带进入宿主细胞进行扩增或表达的工具。
载体的分类：
●按工作方式: 质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体、病毒载体等。
●按功能: 克隆载体和表达载体，表达载体又分胞内表达和分泌表达载体。