标准操作规程目的：建立一个药品微生物限度检验标准操作规程。

范围：适用于本企业生产的所有品种，本企业所有洁净生产区域，QC微生物限度检查室，洁净工作室等。

责任者：QC主任、化验员。

规程：本规程引至《中国药典》2000年版。

1. 概述：微生物限度检查系指非规定灭菌制剂及其原辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。

我公司QC设无菌操作室，用于微生物限度检查。

无菌操作室的管理及使用制度见本文附录一。

2. 抽样：供试品应按批号随即抽样，一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍。

抽样时，凡发现有异常可疑的样品，应缺陷选用疑问的样品，但因机构损伤明显破裂的包装不得作为样品，凡已能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、长霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格，无需要再抽样检验。

3. 供试品的保存：供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，以防供试品中的污染菌因保藏条件所引起致死、损伤或繁殖。

供试品在检验之前，应该保持原有包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。

4. 检查：4.1. 使用设备：电热恒温培养箱、电热恒温水温箱、试管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培养皿、试管架、注射器、针头、注射器盒、研钵、75％酒精棉球、紫外灯（365nm波长）。

4.2. 检查的全过程应严格遵守无菌操作，严防再污染。

使用设备、仪器、人员及无菌操作室常用的消毒、灭菌方法见本文附录二。

除另有规定外，供试品制备成供试液后，均在均匀状态取样。

制成供试液后，应该在60分钟内注皿操作完毕。

标准操作规程4.3. 培养：除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30－35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25－28℃，控制菌培养温度为36±1℃，检验结果的报告以1g、1ml或10cm2为单位。

4.4. 复检4.4.1. 菌数测定不合格者应复检，控制菌检查以一次检出为准，不再复试，但应保留检出菌株一个月备查。

4.4.2. 以复试项下不合格项目为准，作单项复试。

复试需另取同批号样品，测定2次。

4.4.3. 复试报告，以3次测定结果的算术平均值报告。

4.5. 检验报告4.5.1. 检验报告以1g、1ml或10cm2为单位。

4.5.2. 测定菌数报告，以每次测定结果全部平均值报告。

4.5.3. 控制菌按检验结果报告，如未检出控制菌时，报告为“按规定抽样检验结果未检出XX菌”，如抽样中任意一样品要检出控制菌时，报告为“按规定抽样，检出XX菌，不符合药品微生物限度标准。

”4.6. 培养基、试药及稀释剂的相关内容见本文件附录三。

4.7. 供试液的制备：按供试液的理化特性与生物学特性可采取适宜的方法制成供试液。

4.7.1. 供试品的取样及注意事项供试品取样应有一定数量，以使检验结果具有代表性，正常的供试品一般每批应随机抽取两瓶或两盒以上的包装单位，检验时每次应分取两瓶(盒)以上的样品共10g或10ml。

供试品在检验前，应严格保持包装的原有状态，不得启开，并放在阴凉干燥处，防止微生物再繁殖，以免影响检验结果，凡已将原包装启开，则无代表性应另取样。

供试品稀释后须在1－2小时内操作完毕，防止微生物繁殖或死亡。

供试品稀释成供试液后，应在均匀状态下取样，凡因抑菌或不溶于水的剂型，其供试品应作特殊处理后进行检验。

4.7.2. 液体供试品：取供试品10ml，加入稀释剂90ml中，混匀，作为供试液。

油剂可加适量聚山梨酯80，混匀，吸取相当于10g或10ml供试品，标准操作规程再稀释成100ml作为供试液；合剂（系指含王桨或蜂蜜者，下同）可用供试品作为供试液。

4.7.3. 固体、半固体或黏稠液供试品：称取供试品10g，置0.9%无菌氯化钠溶液100ml中，用匀浆仪或其他适宜的方法混匀后作为供试液。

在制备过程中，必要时可加适量聚山梨酯80，并适当加温，但不应超过45℃。

（1）非水溶性供试品：取供试品5g（5ml）加入含溶化的无菌司盘80 5g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃左右的0.9%无菌氯化钠溶液约80ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为供试液（1︰20）。

（2）肠溶胶囊（片）供试品：称取供试品10g，置含无菌磷酸盐缓冲液（pH6.8）100ml的锥形瓶内，于45℃水浴中，保温、振摇，使溶解，作为供试液。

（3）含抑菌成分的供试品照《中国药典》2000年版附录“微生物限度检测法”制备供试液。

4.8. 对照用菌液4.8.1. 控制菌检查均应作相应已知菌的对照试验，大肠杆菌的对照菌株为[CMCC(B)44 102]，其余对照菌株见《中国药典》2000年版附录。

取相应菌株的营养基斜面新鲜培养物1白金耳，接种至营养肉汤培养基内，培养18－20小时后，稀释至1︰106。

对照菌的加入量为50－100个。

4.8.2. 菌种短期保存法：凡使用菌种，一般接种在普通琼脂斜面上，经37℃培养18－20小时，取出在5℃的冰箱内保存备用即可，每月接种传代一次，数周内不致死亡。

4.9. 检查法4.9.1. 检查前的准备：A. 用具的洗涤与灭菌。

试管：使用过的试管经消毒后，将培养基倒出，用清洁液洗刷，用纯化水冲洗4－5次，倒立，晾干备用。

灭菌前，用棉塞塞上管口，牛皮纸包紧，扎紧。

标准操作规程B. 吸管：使用过的吸管用清洁液浸泡数分钟后，用纯化水冲洗4—5次，晾干，备用。

灭菌前，在吸管上端距0.5cm处塞入约2cm左右的适当疏松棉花，用牛皮纸裹紧。

C. 研钵：使用过的研钵用清洁液洗刷后，用纯化水冲洗数次，晾干备用。

灭菌前，用牛皮纸将钵体和锤包裹。

D. 培养皿：使用过的培养皿经消毒后，将培养基倒出，用清洁液洗涮，用水冲洗4－5次，倒立、晾干各用。

灭菌前，根据消毒器内经大小用牛皮纸包数个培养皿，扎紧。

将上述包好的用具，放在121℃的高压蒸汽消毒器中，灭菌30min后，放入微生物限度检查室定点位置，备用。

将所有已灭菌的培养皿、三角瓶、吸管（1ml、l0ml）、稀释剂及供试品等移至无菌室内。

每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中人出操作间。

将全开启无菌室紫外线杀菌灯和空气过滤装置并使其工作30min。

操作人员用肥皂洗手，关闭紫外线杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋，再用0.1%新洁尔灭或用75%乙醇棉球擦手，并擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口周围，待干后将供试品瓶、盒、袋启封，启封后先检查瓶盖内侧及瓶口周围有无生霉、长螨的迹象，对肉眼可见疑似者，若经证实为生霉、长螨即可判定为不合格，无须继续检验。

4.9.2. 细菌、霉菌、酵母菌计数。

4.9.2.1. 检查程序（如下列图1）。

. 操作步骤a.?供试液制备：经阴性对照联样后，按各类制剂备供试液的方法（见10供试液的制备）制备。

b. 稀释及取样稀释：取1ml吸管1支，吸取混匀的1︰10供试液（或原液，1：20供试液）1ml，在离稀释剂液面上约1cm处，测管壁注入装有9ml的稀释剂的试管中，混匀成1︰100（或1︰10，1︰200）的稀释液。

吸样：用上述吸管分别取1︰10供试液（或原液，1︰20供试液）1ml，注入2~3个平皿中，以另一支1ml吸管，按上述操作下一级的稀释与吸取。

c. 注皿与干燥标准操作规程倾注15个以下两平板菌落数允许幅度0~4，2~5，2~9，4~12，5~14，6~13，7~14）。

f. 菌数报告规则细菌一般宜选取平均平板菌落数30~300间的稀释级，作为菌数计算的依据，霉菌宜选取平均菌数在30~100之间的稀释级作为菌数计算的依据。

若在1个稀释级的平均平板菌落数处于30~300（30~100）之间时，将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数，为报告菌数。

若有2个稀释级的平均平板菌落数处在30~300（20~100）之间时，按下式计算两级比值。

当比值＜2时，以两级的菌落数均值为报告菌数；当比值＞2时，以低稀释级平均平板菌落乘以稀释倍数为报告菌数。

若有3个稀数级的平均平板菌数处在30~300（30~100）之间时，采用后2个稀释级计算级间比值。

当比值＜2时，以两级的菌落数均值为报告菌数；当比值＞2时，以低稀释平均平板菌落数乘以稀释倍数为报告菌数若各稀释级平均平板菌数均在300以上，按最高的稀释级的平均平板菌落数第六以稀释倍数为报告菌数，或适当增中稀释数，重作测定后报告结果。

若各稀释级的平均平板菌落数均不在30~300间，其中稀释级的平均平板菌落数大于300，相邻稀释的平均平板菌数又小于30时，以最接近30或300的稀释级平均平板菌落数乘以稀释倍数为报告菌数。

若各稀释平均平板菌落数均小于30小时，按最低稀释级的平均平板菌落数乘以稀释倍数为报告菌数，但若用原液为供试液，当1︰10稀释级与原液的平均平板菌落数相等或大于时，应以培养基稀释法测定。

标准操作规程g. 培养基稀释法：取供试液（原液或1︰10，1︰100供试液）3份，每份各1 ml，分别注入5个平皿内（每皿积压为2 ml），每个平皿倾注营养琼脂培养基约15 ml，混的菌落数，共得3组数据，稀释级平均菌落数小于1时，则报告菌数为小于10个。

h. 报告数书写（细菌数报告规则举例）注：(1) 菌落数在100个以内时，按实测数书写报告。

(2)菌落数大于100时，取二位有效数字，第三位数按有效数字处理规格处理，为简便计，也可用不着0的指数报告。

(3) 不得按计数规则报告的情况:空白对照平板有菌生长，表明培养基已被污染；各稀释级平板上生产的菌落数不任何10倍递增稀释规律，菌数显示混乱；同一稀释级的两个平板上生长的菌落数均在15个以上，但菌数相关一倍以上；菌落蔓延生覆盖整个平板无法计数；出现以上情况，该次实验数据不得计数报告。

4.9.3. 大肠杆菌检查法；标准操作规程检验程序（见附页）. 操作步骤标准操作规程标题药品微生物限度检验方法标准操作规程颁发部门质量管理部编号SOP－QC－028－01 页次：9/12 取胆盐乳糖培养基3份，每份100 ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌50~100个作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。

培养18~24小时（必要可延至48小时）。

阴性对照应无菌生长。

取上述3份的培养物各0.2ml，分别接种5 ml MUG培养基管内培养，分别于5小时与24小时，取未接种的MUG培养基管作本底对照，将各管置365nm紫外光下观察。

阳性对照管呈现荧光，MUG阳性。

供试液的MUG管呈现荧光，MUG阳性；无荧光，MUG阴性。

然后加数滴靛基质试液于MUG管内，液面呈玫瑰红者为阳性，呈试剂本色为阴性。

当阴性对照呈阴性，阳性对照正常生长，供试液胆盐乳糖培养基培养液澄明，并证明无菌生长，判未检出大肠杆菌。

供试液MUG阳性，靛基质阳性，判断检出大肠杆菌；MUG阴性，靛基质阴性，判未检出大肠杆菌。