扬州工业职业技术学院2009 — 2010学年第二学期毕业设计（论文）（课程设计）课题名称：多菌灵残留的生物降解研究设计时间：2010.12.10—2011.12.25系部：化学工程系班级：0803生物化工姓名：刘佳指导教师：田连生目录摘要 (3)Abstract (4)1 绪论 (5)1.1农药污染的危害 (5)1.2 我国土壤农药污染现状 (6)1.2.1 常用化学农药的种类和特点 (6)1.2.2 我国土壤农药污染现状 (6)1.3 农药污染带来的各方面影响 (7)1.3.1 农药污染对土壤生物的影响 (7)1.3.2 农药污染对农作物的影响 (8)1.3.3 农药污染对农产品的影响 (8)1.4 多菌灵的理化性质 (9)1.5 存在问题及研究意义 (9)1.6 多菌灵降解方式 (10)1.7 多菌灵降解的意义 (10)2 实验部分 (12)2.1 试验材料 (12)2.2 实验仪器 (12)2.3 多菌灵降解菌的分离与纯化 (12)2.4 种子液制备 (12)2.5 16SrDNA序列分析 (13)2.6 多菌灵降解率的检测 (13)2.7 多菌灵浓度的影响 (14)2.8 氮源对菌株降解多菌灵的影响 (14)2.9 pH值对菌株降解多菌灵的影响 (14)2.10 培养温度对菌株降解多菌灵的影响 (14)3 结果与讨论 (15)3.1 菌株的筛选与鉴定 (15)3.2 多菌灵浓度对降解率的影响 (15)3.3氮源多菌灵降解的影响 (15)3.4 pH值多菌灵降解的影响 (16)3.5 培养温度对多菌灵降解的影响 (16)3.6 讨论 (17)4 结论 (18)参考文献 (19)致谢 (20)多菌灵残留的生物降解研究刘佳0803生物化工摘要：本文采用富集培养法，在长期施用多菌灵的土壤中分离纯化得到一株对多菌灵降解效能高的菌株RF33-2。
经生理生化和序列同源性分析，鉴定为短小芽孢杆菌。
菌株RF33-2降解多菌灵的最适pH值6.0～10.0，最适温度35.0～40.0 ℃。
该菌株在多菌灵浓度为1O、3O、50、100、300 mg/L 的无机盐培养基中，30 ℃振荡培养24 h后，其对多菌灵的降解率分别为42.44％、48.97％、77.19％、78.66％和9O.O7％。
外加有机氮源如酵母浸出粉、胰蛋白胨、酵母膏可促进该菌株对多菌灵的降解效果，而无机氮源尿素的加入会抑制对多菌灵的降解作用。
关键词: 多菌灵；残留；生物降解；降解率Biodegradation of Carbendazim residuesLiu jia0803 Bio-ChemicalAbstract：Carbendazim is a benzo-pyrazole pesticides because the crop residues on the longer term, so on its residue analysis has been more and more attention. In this paper, the long-term application of carbendazim purified from the soil of one pairs of carbendazim degradation of performance of a high strain RF33-2. The physiological and biochemical and sequence homology analysis, the bacterial degradation of carbendazim optimum pH value of 6.0～10.0, and the optimum temperature of 35.0～40.0 ℃. Bacterium in the carbendazim concentration of 10, 30, 50 , 100,300 mg/L of the inorganic salt medium, 30% after 24 h shaking culture, its degradation rate of carbendazim were 42.44%, 48.97%, 77.19%, 78.66%, and 90.07%. Add a small amount of organic nitrogen sources such as yeast extract, tryptone, yeast extract can promote the degradation of carbendazim strains, add a small amount of inorganic nitrogen sources urea inhibit strains of carbendazim degradation.Keywords：Carbendazim； residue； bio-degradation； degradation rat1 绪论1.1农药污染的危害[1]在人类农业生产中，农药很早就被用于农作物病虫害的防治，在农业经济的发展中起着十分重要的作用。
由于农药具有成本低、见效快、省时省力等优点，在世界各国的农业生产中被广泛生产使用，仅1985年，世界的农药产量就达200多万t。
然而大量化学农药，特别是高毒、高残留、难降解农药的使用，是造成环境污染的主要“杀手”。
据美国康奈尔大学研究发现：全世界每年使用农药400余万t，而实际发挥效能的仅有1%，其余99%都散逸于土壤、空气及水体之中，造成环境污染。
农药污染范围广，面积大，时间长，不仅污染农作物和土壤，而且还进一步污染到地面水体和地下水以及海洋环境，它们在杀死靶标生物的同时，也或多或少地杀死非靶标生物，对周围环境乃至整个生态环境造成严重的破坏，直接威胁着人类的生存环境和身体健康。
农药进入环境主要有三种途径：一是农药直接喷洒在土壤中用于防治地下害虫、去除杂草；二是为防治病虫草害而喷洒于作物叶面，其中至少会有90%的农药落入土壤当中；三是在喷雾和喷粉使用农药时，部分农药弥漫于大气中，并随着气流和风迁移，散布到环境的各个角落。
叶面呼吸大气中农药蒸汽根部吸收土壤水溶液农药植物吸收农药的途径表皮渗透土壤大气中农药大气中农药干湿沉降图1 植物吸收农药的途径农药对人、畜健康和地球生态安全的影响也是当今备受关注的热门话题。
20世纪60年代，有机氯农药污染给自然环境带来的严重后果最先被人们认识；70年代初，六六六和DDT被逐出杀虫剂家族；80年代初，有机磷农药的剧毒品种被清除出常规农用化学品名单；90年代以来，包括杀虫剂、除草剂、杀菌剂和植物激素等数十种农药在内的环境激素类化学农药和持久（难降解）有机毒物的危害性及其监控问题成为人们关注的焦点，它们对动物的毒性主要有：1)影响人和动物生殖繁衍，造成动物雌性化、腺体病变和后代生命力退化；2)引起动物脏腑器官功能和免疫功能下降；3)“三致”作用（致癌、致畸、致突变）。
这不仅直接危害到人类健康，而且可造成许多野生动物的种群消亡，引发地区生态危机和生物多样性。
而环境激素类化学农药目前在我国产销应用量巨大，特别是多菌灵是目前农业上防治植物病害的主要杀菌剂。
因此，其在环境中残留的降解，已成为我国急待解决的问题。
1.2 我国土壤农药污染现状土壤是人类环境的基本要素之一，是人类赖以生存和进行生产活动的物质基础，它与人类健康有着密切的联系。
在巨大人口压力和耕地减少的情况下，农林土壤大量施用化肥、农药以及其他一些化学物质，而且其施用量将可能在很长时间内维持较高的水平，这些化学物质在土壤中不断积累，使生态系统受到严重的干扰和破坏，引起土壤环境恶化、土壤肥力下降和土壤生产力下降等负面效应，极大的影响了农林耕地的可持续利用，也使污染土壤的面积进一步增加，这种增加在发展中国家表现的更为明显，因此，农药污染土壤修复技术的研究，将成为农业环境治理的热点领域。
1.2.1 常用化学农药的种类和特点化学农药按其功能不同，主要分为杀虫剂、除草剂和杀菌剂三大类；而依据化学结构不同，可分为有机氯类、有机磷类、拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类和无机农药等多种类型。
这些化学农药的共同特点是：⑴有毒性，且靶向性差；⑵残留性，一般分为高残留、中残留和低残留等；⑶迁移性和累积性，可通过空气、土壤或地下水发生迁移，甚至在生物体内累积。
1.2.2 我国土壤农药污染现状我国是农业大国，每年平均发生病虫害约27～28亿亩次，农药，尤其是化学农药的使用，依然是保证粮食作物增产、稳产的重要和有效手段。
目前，全国农业使用化学农药为80～100万t左右，有机磷农药占40%，高毒农药占37.4%，这些农药无论以何种方式施用，均会在土壤残留，而且在我国农药的有效利用率低，据测定仅为20%～30%（发达国家的有效利用率为60%～70%）。
若按单位面积施药量计算，我国农药用量是美国的2倍多。
根据23个省(自治区/直辖市)的统计，2000年共发生农业环境污染事故891起，污染农田4万hm2，直接经济损失达2.2亿元[6]。
据联合国的一份统计资料表明，我国的农副产品因为化学农药的残留问题，每年有74亿美元的出口商品受到不利影响。
在相当长的一个时期内，人们对农药的使用主要是着眼于对有害生物的防治和提高经济效益，然而，对于施用后进入人类和动植物生存的生态环境中可能产生的不良影响未给与足够的重视。
化学农药大量使用，一方面杀死了许多无辜的生物，破坏了生态系统的平衡；另一方面，又通过食物链的富集和放大作用，给人类和高等动物造成严重的危害。
有机磷和有机氯农药是造成土壤农药污染的主要种类。
目前世界上的有机磷农药商品达上百种，在我国使用的有机磷农药约30余种，使用量为20万t，其中80%以上是剧毒农药，如甲胺磷、甲基对硫磷、对硫磷、久效磷、敌敌畏等，其中甲胺磷的使用量一年就高达6.5万t。
目前我国有机磷农药占据农药主导地位的局面难以在短期内改变，仍将长期使用。
有机氯农药是造成土壤农药污染的另一大类，我国有机氯农药的主要污染地区集中在华北和华东地区，在土壤、农产品、河流沉积物中都检测到了该类农药的残留。
2000年太湖流域农田土壤中15种多氯联苯同系物检出率为100%，六六六、DDT超标率为28%和24%，上海市郊区农田中的DDT含量严重超标，南京市菜地土壤中六六六和DDT的检出率为100%。
虽然随着时间的推移，这些禁用有机氯农药的残留在逐渐降低，但目前仍在使用的有机氯农药如二氯杀螨醇、五氯酚和五氯酚钠等，同样造成土壤、植物和水源的污染。