微机模拟蛋白质纯化实验一、实验目的：1. 了解模拟生化干实验的方法和意义，掌握用protein软件提纯蛋白质的方法。

2. 进一步熟悉层析、热变性、盐析等常用生化分离方法的原理和应用。

二、实验原理：“Protein”软件有36个任务，即36组待分离纯化的蛋白。

任务要求利用软件提供的几种实验技术，提纯每一个目的蛋白，最终达到单向电泳一条带，双向电泳一个点，而且使用的人时和经费(根据提取步骤计算得到)不得超过一个特定值。

在每个任务开始时，软件给出目的蛋白的一些性质，如热稳定的温度范围和pH稳定范围等，利用这些信息，可以使实验少走弯路。

“Protein”提供的分离纯化方法有七种：①热变性；②硫铵沉淀；③排阻层析(凝胶色谱)；④离子交换层析；⑤吸附层析；⑥聚焦层析；⑦制备电泳。

在“Protein”所提供的各种分离纯化方法中，热变性法和盐析法是比较好的粗提方法，在提纯的早期使用效果较好。

层析是各种方法中最强有力的方法，制备电泳虽然纯化倍数高，但是回收率低。

在各种层析方法中，又以离子交换层析最为有效和易于使用，并且耗费的人时和经费也较少。

排阻层析和聚焦层析耗费较大，但在某些特定情况下，这两种方法是不可替代的。

“Protein”提供了四种电泳方法：即，SDS-PAGE、PAGE、等电聚焦电泳和双向电泳。

这些电泳方法不但可以用以检测样品的纯度，而且也给出了样品的一些信息，如分子量、等电点等，这些信息对于后续提纯有重要的参考价值，等电聚焦电泳和PAGE还可以用于制备。

本实验要求完成实验软件中三种酶的分离纯化。

三、实验步骤：实验中为了比较在样品性质不同情况下，如何有效分离，以及各种方法的优劣，拟分离如下三种样品：1. pH稳定范围较大的蛋白（Windows 1号酶）2. 酸性条件下稳定的蛋白（Windows 3号酶）3. 碱性条件下稳定的蛋白（Windows 36号酶）1.pH稳定范围较大的蛋白（Windows 1号酶）1号酶在50度下稳定，稳定范围2-11(稳定范围较大)（1）分离纯化步骤：先通过DI－DEM看一下样品的情况：pH3~10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）由图片可以看出，杂蛋白含量比较少，各种蛋白的Mr和pI相差较大。

A.硫铵沉淀法初始百分饱和度0，终末饱和度50%，收集沉淀B.离子交换层析：填料：DEAE-Sephadex A-50,柱长=10CM，柱内径=2CM；缓冲体系：乙酸-乙酸钠（pH3.6-5.8），pH4.4，流速0.3ml/min；离子强度梯度洗脱：0.01mol/L-0.15mol/L，洗脱体积：300ml。

（如下图）洗脱曲线如下图：由洗脱曲线可以看出，目的酶和杂蛋白有一定的重合，可以通过收集来避免一些杂蛋白的干扰，收集70-95ml的组分，做如下检验。

（2）检测纯化结果：A.二维电泳：pH3-10，分离胶浓度10%（体积分数），浓缩胶浓度3%（体积分数）已达一个点的要求。

B.PAGE 缓冲体系：乙酸-乙酸钠（3.6-5.8），pH=5结果显示一条带，证明纯化效果不错。

再用SDS-PAGE对比一下。

C.SDS-PAGE：分离胶浓度10%（体积分数），浓缩胶浓度3%（体积分数）经检验，发现有两条很近的带，故目的蛋白提纯不够彻底，应对收集到的70-95ml的组分继续用离子交换层析。

（3）第二次离子交换层析：填料DEAE－Sephadex A-50，柱长：10cm，柱内径：2.0cm，缓冲体系：磷酸氢二钠-Citrate（2.2－8.0），pH 4.3，流速：0.3ml/min，离子强度梯度洗脱：0.01mol/L-0.15mol/L，洗脱体积：300ml。

（如下图）洗脱曲线如下：收集10-40ml组分后进行蛋白质纯化检测（4）第二次检测纯化结果：A.二维电泳，pH 3～10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）已达到一个点的要求。

B.PAGE 缓冲体系：乙酸-乙酸钠（3.6-5.8），pH=5用PAGE检验，已达到一条带的要求，作为对比再用SDS－PAGE检验。

C.SDS-PAGE：分离胶浓度10%（体积分数），浓缩胶浓度3%（体积分数）SDS－PAGE检验结果显示，有一条带。

此次分离效果很好，整体的分离效果比较好，花费较少。

（5）实验结果分析：1号目的酶的Mr约为29000，PI=4.4。

稳定pH 2～11,稳定温度<50℃。

2.酸性条件下稳定的蛋白（Windows 3号酶）3号酶在62℃以下稳定，稳定pH范围3.8～5.8（酸性条件）（1）分离纯化步骤:先通过DI－DEM看一下样品的情况：pH3~10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）由图片可以看出，杂蛋白含量比较少，各种蛋白的Mr和pI相差较大。

我们可以利用热变性或者是硫铵沉淀的办法进行初提纯处理。

A.热变性：水浴温度61℃，水浴时间60min，可以得到22.162g,99%的酶活力初提取效果很好。

B.硫铵沉淀：初始百分饱和度40％，终末百分饱和度80％(质量分数)，收集沉淀组分。

C.吸附层析：填料Bio-Gel HTP，柱长：35cm，柱内径：2.0cm，缓冲体系：乙酸-乙酸钠（3.6－5.8），pH 5.0，流速：0.3ml/min，离子强度梯度洗脱：0.02mol/L-0.30mol/L，洗脱体积：300ml洗脱曲线如下：由洗脱曲线可以看出，目的酶和杂蛋白有一定的重合，可以通过收集来避免一些杂蛋白的干扰，收集72-96ml的组分，做如下检验。

（2）检测纯化结果：二维电泳：pH3-10，分离胶浓度10%（体积分数），浓缩胶浓度3%（体积分数）出现两个点，不符合要求，进行凝胶层析分析。

（3）凝胶层析：填料Sephadex G-75，柱长：100cm，柱内径：2.0cm，缓冲体系：磷酸氢二钠-Citrate（2.2－8.0）pH 5.6，浓度0.02mol/L，流速：0.3ml/min，洗脱曲线如下收集290-340ml的组分，做如下检验。

（4）第二次进行蛋白纯化检验：A.二维电泳：pH3-10，分离胶浓度10%（体积分数），浓缩胶浓度3%（体积分数）已达到一个点的要求。

B.PAGE 缓冲体系：分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数），缓冲体系：磷酸二氢钾-NaOH，pH 8.0用PAGE检验，已达到一条带的要求，作为对比再用SDS－PAGE检验。

C.SDS-PAGE：分离胶浓度20%（体积分数），浓缩胶浓度3%（体积分数）已达到一条带的要求，此次分离效果很好，整体的分离效果比较好，花费较少。

（5）结果分析：3号蛋白Mr约为6800，p I=6.0，稳定pH 3.8～5.8,稳定温度<62℃。

3.碱性条件下稳定的蛋白（Windows 36号酶）36号酶在31度下稳定，稳定pH范围7.7-10（1）分离纯化步骤：先通过DI－DEM看一下样品的情况：pH3~10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）由图片得知，蛋白比较杂，在pH7.2-10这个范围内，蛋白质的分子量差异较大，比较分散。

目的酶的温度比较低，故不用热变性法，在用硫铵沉淀法后发现对杂蛋白的分离效果不大，所以直接用细分离。

A.吸附色谱填料：氧化铝，柱长=35CM，直径=2CM；缓冲体系：Gly-NaOH（pH8.6-10.6），pH8.6。

洗脱曲线如下：由洗脱曲线可以看出，目的酶和杂蛋白有一定的重合，可以通过收集来避免一些杂蛋白的干扰，收集210-280ml的组分，做如下检验。

（2）蛋白纯化检验：发现各种蛋白的Mr和pH差异比较大，用凝胶过滤层析和离子交换层析都可以。

（3）第二次分离纯化：离子交换层析：填料：DEAE-Sephadex A-50,柱长=10CM，柱内径=2CM；缓冲体系：Gly-NaOH（pH8.6-10.6），pH=8.6，流速0.3ml/min；离子强度梯度洗脱：0.01mol/L-0.15mol/L，洗脱体积：300ml。

（如下图）洗脱曲线如下：由洗脱曲线可以看出，目的酶和杂蛋白有一定的重合，可以通过收集来避免一些杂蛋白的干扰，收集70-100ml的组分，做如下检验。

（4）第二次蛋白纯化检验：A.二维电泳：pH3-10，分离胶浓度10%（体积分数），浓缩胶浓度3%（体积分数）已达到一个点的要求。

B.PAGE 缓冲体系：Gly-NaOH（pH8.6-10.6），pH8.6。

由图可以看出，除了目的蛋白的条带外，在它上面还有一条浅浅的带，杂蛋白未除尽。

由杂蛋白和目的蛋白条带的接近程度可大致得出，杂蛋白和目的蛋白的PI接近。

作为对比再用SDS-PAGE 检测一下。

C.SDS-PAGE：分离胶浓度10%（体积分数），浓缩胶浓度3%（体积分数）结果显示，只有一条清晰的带。

二维电泳一条带，PAGE虽两条带，不过杂蛋白的量很少，条带不明显。

如果接下来的实验对蛋白纯度要求不是特别高，达到上述纯度即可。

（5）实验结果分析：36号目的酶的Mr约为30800，PI=8.4。

稳定pH 7.7～10,稳定温度<31℃。

实验小结：这次实验的情况让我了解了各种蛋白质的相关性质的测定方法，同时也了解到了相关的方法的一些具体的操作过程，学到了很多书本上没有的知识。

实验的结果整体比较令人满意，用的相关步骤也是比较简单省钱的，所以效果比较好！不过还是有些遗憾就是第三个在等点检测和PAGE 检测的时候是出现了两条带，说明自己还有很多的不足需要进一步的学习！。