微机模拟蛋白质纯化实验
学号： 1035130150
：睿
班级：生命科学学院 10级生物工程
： 1059508633qq.
一、实验目的：
1. 了解模拟生化干实验的方法和意义，掌握用protein
软件提纯蛋白质的方法。

2. 进一步熟悉层析、热变性、盐析等常用生化分离方法
的原理和应用。

二、实验原理：
1：“Protein”软件有36个任务，即36组待分离纯化的蛋白。

任务要求利用软件提供的几种实验技术，提纯每一个目的蛋白，最终达到单向电泳一条带，双向电泳一个点，而且使用的人时和经费(根据提取步骤计算得到)不得超过一个特定值。

在每个任务开始时，软件给出目的蛋白的一些性质，如热稳定的温度围和pH稳定围等，利用这些信息，可以使实验少走弯路。

2：“Protein”提供的分离纯化方法有七种：①热变性；
②硫铵沉淀；③排阻层析(凝胶色谱)；④离子交换层析；
⑤吸附层析；⑥聚焦层析；⑦制备电泳。

3：在“Protein”所提供的各种分离纯化方法中，热变
性法和盐析法是比较好的粗提方法，在提纯的早期使用效果较好。

层析是各种方法中最强有力的方法，制备电泳虽然纯化倍数高，但是回收率低。

在各种层析方法中，又以离子交换层析最为有效和易于使用，并且耗费的人时和经费也较少。

排阻层析和聚焦层析耗费较大，但在某些特定情况下，这两种方法是不可替代的。

4：“Protein”提供了四种电泳方法：即，SDS-PAGE、PAGE、等电聚焦电泳和双向电泳。

这些电泳方法不但可以用以检测样品的纯度，而且也给出了样品的一些信息，如分子量、等电点等，这些信息对于后续提纯有重要的参考价值，等电聚焦电泳和PAGE还可以用于制备。

三、实验要求：
完成实验软件中三种酶的分离纯化。

四、实验步骤：
实验中为了比较在样品性质不同情况下，如何有效分离，以及各种方法的优劣，拟分离如下三种样品：
1. pH稳定围较大的1号蛋白
2. 碱性条件下稳定的36号蛋白
3. 酸性条件下稳定的3号蛋白
1：酸性条件下稳定的3号蛋白
3号酶在62℃以下稳定，稳定pH围3.8～5.8（酸性条件）。

以上为总步骤
二维电泳，pH 3～10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）
以上为第一步骤具体参数
以上为第二步骤具体参数
以上为第三步骤集体参数
以上为第三步洗脱曲线
以上为第三步之后的二维电泳，pH 3～10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）
以上为第四步的具体参数
以上为第四步的洗脱曲线
以上为第四步之后的二维电泳，pH 3～10，分离胶浓度20％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）
已经达到一个点的要求
PAGE：分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数），缓冲体系：磷酸二氢钾-NaOH，pH 8.0
已经达到一个点要求
SDS-PAGE：分离胶浓度20％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）。

已经达到一条线要求
由以上试验可得酶活力回收91.86％，纯化倍数为20.577，耗费986.8054元，费时35小时。

2：碱性条件下稳定的36号蛋白36号酶在31度下稳定，稳定pH围7.7-10
以上为总步骤
二维电泳，pH 3～10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）
第一步的具体参数
第一步的洗脱曲线
第一步之后的二维电泳，pH 3～10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）
第二步的具体参数
第二步的洗脱曲线
二维电泳，pH 3～10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）已经达到一个点
PAGE 缓冲体系：Gly-NaOH（pH8.6-10.6），pH8.6。

可以看出，已经基本达到一个点。

SDS-PAGE：分离胶浓度10%（体积分数），浓缩胶浓度3%（体积分数）
已经达到只有一条清晰的线
由以上试验可得酶活力回收93.01％，纯化倍数为15.605，耗费340元，费时20小时。

3： pH稳定围较大的1号蛋白
1号酶在50度下稳定，稳定围2-11(稳定围较大)
以上为总步骤
二维电泳，pH 3～10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）
以上为第一步的具体参数
以上为第二步的具体参数
以上为第二步骤的洗脱曲线
以上为第二步后二维电泳，pH 3～10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）
以上为第三步的具体参数
以上为第三步的洗脱曲线
二维电泳，pH 3～10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）已经达到一个点
PAGE：分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数），缓冲体系：磷酸二氢钾-NaOH，pH 8.0
已经达到一个点要求
SDS-PAGE：分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）。

已经达到一条线要求
由以上试验可得酶活力回收95.07％，纯化倍数为5.746，耗费752.7元，费时25小时。