蛋白质纯化一、目的:利用金属亲和性管柱(metal affinity column)来大量纯化带有affinity tag的基因重组蛋白。

二、原理:由于六个Histidine 所组成的His Tag (metal affinity tag)可与Ni2+ bind，所以利用基因重组技术在表现的蛋白质加上His Tag，再以金属亲和性管柱(Ni-NTA) (此His- tag序列可与带二价正电的阳离子相螯和)及liquid chromatography来大量纯化蛋白质。

三、试剂与器材:1.loading(binding) buffer (10mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HClPh7)✧细菌回溶成为蛋白质的载体以保持活性2.wash buffer (20mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7)3.elution buffer (20mM EDTA,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7)上课补充:✧蛋白质很脆弱，需要在特殊的buffer里。

四、仪器与设备:FPLC(速液相色谱仪)五、步骤:1.将管柱架在铁架上，把亲和性胶体悬浮装填于管柱内。

2.以2~3倍CV loading buffer清洗管柱后，注入蛋白质样本。

3.以wash buffer梳洗，2到3倍column体积。

4.用wash buffer和elution buffer进行线性梳洗，并收集流出液体，以FPLC UV monitor上的OD280数据读取样品流出与否，并观察冲离液之曲线图。

上课补充:✧胞内型分泌需要用超音波破菌，因为会放热所以要放在冰中使用。

✧线性梳洗为加入elution buffer会有颜色变化会把镍离子跟imidazole冲洗掉，剩下胶体溶液。

✧其中imidazole和Histidine类似也会和镍离子结合所以会竞争，可拿来洗涤蛋白质。

(可详见问题一及补充资料2)六、问题:问题一: Imidazole的结构与特性。

Imidazole又名咪唑即1,3-二氮唑，是一个五元杂环芳香性有机化合物，化学式C3H4N2。

它也是一个生物碱。

白色或浅黄色固体结晶，可溶于水、氯仿、醇、醚，具有酸性，也具有碱性。

氢原子在两个氮原子之间移动，因此存在两个互变异构体。

咪唑环结构在生物分子中广泛存在，例如组氨酸和对应的荷尔蒙组胺。

很多药物也包含有咪唑环，例如硝基咪唑和咪唑类抗真菌药物。

结构与性质咪唑为平面五元环状化合物，易溶于水（以无限比例）和其它极性溶剂。

咪唑的两个氮原子间存在永久偶极，极性很强，偶极矩为3.61D，并且分子间存在氢键缔合，导致了咪唑具有反常高的沸点（256°C）。

分子中存在一个6电子共轭大π键，故具有典型的芳香性。

与氢以σ键相连的氮原子提供一对电子，环内其余四个原子各提供一个电子成键。

1N上有氢的咪唑环中，氢原子可以在两个氮原子间迁移，存在两个互变异构体，C-4和C-5是等同的。

这两个互变异构体无法分离，当有取代基时，常以「4(5)-取代咪唑」（如4(5)-甲基咪唑）来命名。

组氨酸生成组胺的反应如下所示：咪唑一个用途是在金属螯合亲和层析(IMAC)中用于His标签蛋白的纯化。

标签蛋白与层析柱表面珠孔内的镍离子介质发生结合，过量的咪唑通过层析柱，将与镍配位的标签蛋白洗脱下来，得到高纯度的目标蛋白。

咪唑是许多药品的重要组成部分。

许多杀菌剂和抗真菌、抗原虫和抗高血压的药物中含有合成咪唑。

咪唑是茶叶和咖啡豆中含有的茶碱分子的组成部分，具有刺激中枢神经系统的作用。

通过干扰DNA的活动抑制白血病的抗癌药物巯嘌呤中也含有咪唑。

问题二:2.ETDA的资料(整理)EDTA又名乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)简称：EDTA俗名；依地酸（特别是它的钙盐络合物，医学上称为依地酸钠钙）分子量：292.248分子式：C10H16N2O8为白色无臭无味、无色结晶性粉末，熔点240℃(分解)。

不溶于冷水、醇及一般有机溶剂，微溶于热水，溶于氢氧化钠，碳酸钠及氨的溶液中，能溶于160份100℃沸水。

为一种有机化合物。

它是一个六齿配体，可以螯着多种金属离子。

它的4个酸和2个胺的部分都可作为配体的齿，与锰（II）、铜（II）、铁（III）及钴（III）等金属离子组成螯合物化学家曾经用多种不同的字来形容EDTA，例如将配体本身叫做EDTA4−，而它的共轭酸叫做H4EDTA。

配合物EDTA和金属的螯合物，EDTA 和其他化合物如H2IDA（亚胺基二乙酸）和H3NTA（氨三乙酸）等属于同类的螯合物，这些配体都是由一种叫做甘氨酸的胺基酸制成的。

EDTA类的螯合物都极易溶于水。

这些配体都为三或四齿配体，而合成出来的螯合物都是光学异构物。

用途在1999年欧洲EDTA年消耗量为35,000吨，在美国为50,000吨，其重要的用途如下：∙工业：清理重金属离子及Ca2+和Mg2+离子。

∙肥皂：与硬水中的Ca2+和Mg2+离子结合来降低硬度。

∙摄影：以Fe(III)EDTA作为氧化剂。

∙纺织品：与重金属结合。

∙食物：作为防腐剂来避免重金属的氧化。

∙化妆品：加上EDTA 来保存化妆品。

∙油生产：加上EDTA 来防止矿物沈淀。

∙牛奶：清洗牛奶瓶。

∙氮氧化物：废气的处理。

∙生物医学：o汞毒治疗：使用EDTA的二钠钙盐-乙二胺四乙酸二钠钙[3]（EDTA Na2-Ca）治疗重金属中毒。

可治疗汞中毒的人，也可治疗铅中毒的人。

利用EDTA与重金属结合的特性，生成穏定而可溶的盐，随尿液排出。

o检验医学：作为血液等液体类标本的抗凝剂（如全血细胞计数时所采用的血液标本）。

o牙医学：在根管治疗术中用来清除一些有机或无机的物质。

o生物化学：在分子生物学中用EDTA 来防止金属离子对酶的影响[4]。

∙汽水：汽水中含有的维生素C和苯甲酸钠有机会产生致癌物质苯，可以EDTA来处理。

∙水的测试：测试水的硬度。

环境问题EDTA 不能在污水处理中被分解，不过在控制着pH值的情况下，经长时间后EDTA 就会几乎完全反应了，当其时要将其他微生物抽离，来让EDTA 完成结合的过程。

在水中，太多或太少的螯合物都会影响浮游生物和藻类的数量，可以是增加或者减少。

EDTA 对细菌来说是有毒的，在哺乳类动物的粪便中会破坏生物的细胞膜。

问题三:Tris-HCL是甚么?答:Tris-HCl是三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的英文名称的缩写, 用作生物缓冲剂,添加剂英文名Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride别名2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol hydrochloride; Tromethanehydrochloride; Trizma hydrochloride别名:2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇盐酸盐三羟甲基氨基甲烷盐酸盐分子式:C4H11NO3.HCl分子量:157.59物理化学性质熔点:150-152°C为水溶性SOLUBLE结构式:pKa ( 25℃ ):pH ( 0.5M in water ) 3.5 ~ 5.0问题四:为何使用UV波长为280 nm?答:一般有机物质，对于波长在250 nm 以下的光才有吸收作用，但含有苯环的胺基酸(aromatic amino acids)，对于波长250 nm 以上的光却有吸收作用。

凡含有此等胺基酸的蛋白质，其水溶液对于波长在260 nm至290 nm (通常取280 nm波长)之光，均有吸收作用，其吸收量与蛋白质溶液的浓度成正比。

所以含有phenylalanine、tyrosine或tryptophan的蛋白质，均可采用此法来定量。

利用UV光OD280(波长280nm)可侦测蛋白质的特性，可以将从管柱流出的蛋白质绘出吸收峰图型，在对照圆盘内所收集纯化蛋白质的tube，搭配蛋白质电泳SDS-PAGE观测，取自tube内的液体进行蛋白质电泳，可以更加确定蛋白质的分子量及纯度。

七、补充资料:1. 快速液相色谱仪(FPLC)利用快速液相色谱仪搭配不同性质和特性的纯化蛋白质用的管柱，依照研究目标蛋白质的特性，可以从已破菌的菌液中分离出来。

纯化蛋白质用的管柱，可以分为:亲和性管柱：经典代表为镍金属的树脂，当将研究目标在其蛋白质的头尾端，加上6个His(与镊金属结合形成敖合物)，之后在利用与His类似的化合物，与镍金属结合的蛋白质竞争，进而分离出带走6个His的研究目标蛋白质✧分子筛管柱: 可以依照分子量大小不同，导致流出管柱的时间点不同来分离✧离子树质管柱：利用蛋白质在不同pH值下，会使蛋白质改变其本身的电荷，来达到吸附管柱的效果，将研究目标蛋白质与其他大肠杆菌本身所携带的蛋白质分离。

←快速液相色谱仪(FPLC)2.组胺酸(Histidine)组胺酸缩写:His, H化学式:C6H9N3O2摩尔质量:155.16 g·mol−1p K a2 = 6.0 (咪唑环)而这次实验所使用的六个Histidine结构与镍离子结合如下图3.螯合物与螯合剂螯合物又称内络合物，是螯合物形成体（中心离子）和某些合乎一定条件的螯合剂（配位体）配合而成具有环类架构的配合物。

“螯合”即成环的意思，犹如螃蟹的两个螯把形成体（中心离子）钳住似的，故叫螯合物。

形成螯合物的第一个条件是螯合剂必须有两个或两个以上都能给出电子对的配位原子（主要是N，O，S等原子）。

第二个条件是每两个能给出电子对的配位原子，必须隔着两个或三个其他原子，因为只有这样，才可以形成稳定的五原子环或六原子环。

例如，在氨基乙酸根离子（H2N-CH2-COO-）中，给出电子的羟基氧和氨基氮之间，隔着两个碳原子，因此它可以形成稳定的具有五原子环的化合物。

常用的螯合剂是氨螯合剂，是一类似以氨基二乙酸[HN（CH2COOH）2]为基体的螯合剂，它以N，O为螯合原子，与金属离子螯合时形成环类的螯合物常用的氨羧螯合剂有︰1.氨羧螯合剂Ⅰ（ATA）指的是氨三乙酸2.氨羧螯合剂Ⅱ（EDTA）指的是乙二胺四乙酸。

EDTA是应用最广的一种氨羧螯合剂，用EDTA标准液可以滴定几十种金属离子，这个方法就称EDTA滴定法。

目前所谓螯合滴定法主要是指EDTA滴定。