平板上的转座突变株机器自动挑蓖落・-————-----—-畸到38好L板上培养转到96孔板上・-—__—_____--—’进行P僳I转另一个板I山l转另一个板l山戬.gsT分析数据整理●÷————————————一●}--—---————-—一图1建立转座子突变株库的技术路线子在铜绿假单胞菌PA01基因组中的转座插入采样数不符合泊松分布,虽然如此,但毕竟在最终还是获得了一个近饱和的突变株库。
而Garsin(71等在构建粪肠球菌的Tn917转座插入突变株库时发现,测序的8865个Tn917转座突变株突变基因只对应了610个不同的开放阅读框,远远低于预期的2400个。
这些结果说明使用随机性差的转座子会大大增加建库的成本。
因此,有的研究利用了两种类型转座子构建突变株,这是为了防止一种转座子可能有的插入热区,而造成在基因组插入位点的随机性不佳,进而造成某些基因的突变株在筛选中漏选,而另一些基因的突变株则被多次重复筛选。
两种类型转座子的使用,可以互相弥补,降低发生漏选或者重复筛选的可能性。
例如在建立铜绿假单胞菌PAl4突变株库工作中,最开始采用的是Tn5来源的细菌转座子——hphoA。
如前所述,尽管Tn5来源的转座子插入随机性非常好,研究者还是发现了至少一个热区(Hot spot,即gacA基因,同样也存在一些冷区(Cold spots。
为了避免转座位点的选择性,研究者又采用了真核生物来源的mariner转座子,该转座子能够在很多原核生物中进行转座,而且预计与TnphoA在靶位偏嗜上存在差异,故联合使用可以降低转座选择性;②对突变基因测定方法采用随机引物PCR的方式,以达到自动化的目的。
确定突变株突变基因的方法有很多,如反向PCR等,但这些方法的最大问题是需要人工参与,无法实现完全自动化测序,从而使确定突变基因的工作几乎不可能完成。
而随机引物PCR的方法可以采用机器自动化79进行,使测序工作完全不需要人工的参与,达到省时省力的目的,从而使建库所耗时间和精力大大降低,可以由一个研究组完成而不需要大规模的协作。
图2随机引物PCR测序方法示意图依据以上的方法,目前已经建立了有铜绿假单胞菌PA01和PAl4两个突变株库。
除此之外,针对特定研究目的的某些小规模的突变株库也参考上述方法建立起来,例如Pobigaylo等根据上述方法用mini—Tn5转座子对Sinorhizobium meliloti建立了一个5000个左右的突变株库喁】63建立细菌突变株库的意义建立细菌突变株库的意义不言自明:第一,建立突变株库将大大促进建库细菌的研究。
对细菌基因功能的研究依赖于其突变株的构建,而其构建过程往往耗时耗力。
如果已经有一个完整突变株库的话,其他研究者就不需要作这个耗时耗力的工作了,他只需要将研究的靶基因告诉建库单位,该单位就利用转座子建立细菌单基因突变株库的策略和方法作者:丛延广, 胡福泉作者单位:解放军第三军医大学基础部微生物学教研室,重庆,400038 刊名:微生物学免疫学进展英文刊名:PROGRESS IN MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY 年,卷(期:2008,36(2被引用次数:0次参考文献(8条1.Riley M Genes and proteins of Escherichia coli K-12 (GenProtEC 19972.Kobayashi K.Ehrlich SD.Albertini A Essential Bacillus subtilis genes 2003(083.Giaever G.Chu AM.Ni L Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome 20024.Ecoli genomic project5.Jacobs MA.Alwood A.Thaipisuttikul I Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa 2003(246.Liberati NT.Urbach JM.Miyata S An ordered,nonredundant library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 transposon insertion mutants 2006(087.Garsin DA.Urbach J.Huguet-Tapia JC Construction of an Enterococcus faecalis Tn917-mediated-gene-disruption library offers insight into Tn917 insertion patterns 2004(218.Pobigaylo N.Wetter D.Szymczak S Construction of a large signature-tagged Mini-Tn5 transposon library and its application to mutagenesis of Sinorhizobium meliloti 2006(06相似文献(10条1.学位论文毕志香Tn916诱变的嗜水气单胞菌突变株的特性分析及转座子插入位点的探讨2005嗜水气单胞菌(Ah是重要的水生病原菌,给水产养殖业造成极大的经济损失,同时还是重要的人畜共患病病原菌。
本文研究对象MJ-1即是采用转座子Tn916诱变技术获得的一株多个毒力因子同时缺失的突变株,将其连传20次后,Tn916仍稳定地存在于MJ-1的染色体上。
分析MJ-1的生物学特性,与亲本株相比,其胞外蛋白酶(酪蛋白酶和弹性蛋白酶、淀粉酶、DNA酶、溶血素和S层等几种主要毒力因子不表达;生化特性表明,MJ-1对部分糖的发酵能力丢失;外膜蛋白图谱、胞外产物图谱发生改变;对HEp-2细胞的粘附性小;对EPC细胞和小白鼠的毒力丢失。
MJ-1株同时缺失多种分泌性胞外毒力因子和细胞表面蛋白如S层等,提示嗜水气单胞菌J-1株中可能存在毒力岛。
为确定Tn916的插入位点,采用PCR技术扩增调控胞外蛋白酶分泌的转录调控蛋白(ahyR全长基因,结果未扩增得到,推测Tn916可能插入到ahyR基因中。
进一步采用插入诱变技术构建ahyR基因的突变株以验证Tn916是否插入ahyR基因中。
根据GenBank公布的嗜水气单胞菌转录调控蛋白ahyR基因的序列设计一对特异性引物,利用PCR方法扩增AhJ-1株ahyR基因的部分片段(656bp。
PCR产物克隆入pMD18-T载体,经序列测定后定向连接入含有卡那霉素抗性(Kmr基因的自杀性质粒pJP5603中,构建重组质粒pJP-ahyR。
将鉴定为阳性的重组质粒转化AhJ-1株感受态细胞,获得一突变株细菌。
PCR方法鉴定该突变株为J-1株ahyR基因的同源重组突变株,命名为J-1△ahyR。
同时研究了其主要生物学特性。
采用MJ-1株作为弱毒活疫苗免疫剑尾鱼。
将剑尾鱼分成4组,免疫组每尾腹腔注射菌数分别为107CFU、105CFU、103CFU,对照组注射0.1mL无菌PBS,30d 后采血测血清凝集抗体效价以及血液中白细胞的吞噬活性,而后用20LD50的Ah强毒株J-1株腹腔注射攻击。
每尾注射107CFU组的凝集抗体效价、白细胞的吞噬活性和相对保护力等都比其他免疫组高。
试验结果表明弱毒株MJ-1具有很好的免疫原性并对剑尾鱼具有一定的保护力。
该研究为嗜水气单胞菌弱毒疫苗的研制奠定了基础。
2.学位论文邓平深红红螺菌高产氢突变株的筛选及转座子插入位点分析2008能源危机席卷全球,寻找替代能源势在必行。
氢能以其来源丰富、重量轻、贮能高、燃烧产物是水等优点成为备受关注的新型能源。
光合细菌(photosynthetic bacteria,PSB是一类能进行光合作用并产生氢气的细菌,深红红螺菌(Rhodospirilum rubrum属于兼性厌氧菌,是光合细菌的模式菌株,具有非常重要的研究价值。
此外,光合细菌还能分解多种有机物。
光能利用,产氢和处理有机废物、废水结合于一体的特性,使光合细菌显示出了巨大的研究价值。
转座子作为遗传学研究的重要工具,能够插入基因组中造成插入突变。
利用转座子进行菌株诱变,能够得到较稳定的突变株。
并且通过一定的方法,获得侧翼序列,将有利于在分子水平上对产氢机制进行深入的探讨。
二氯化钯(PdCl2溶液能与氢气等还原性气体发生反应而析出黑色的金属钯。
本研究据此设计了一种快速筛选高产氢光合细菌突变株的方法。
即在96孔深孔培养板中培养光合细菌并使其产氢,用浸润PdCl2的脱脂棉片封盖,以观察对应孔的棉片颜色变化程度来筛选高产氢的突变株。
本研究利用转座子构建了光合细菌Tn5随机插入突变库,并应用此法在其中进行了筛选,对选出的高产氢突变株进行发酵,用气相色谱检测其产氢情况,结果发现两种方法得出的结论并不一致,对此情况进行了讨论,提出了改进的方法,为快速筛选高产氢菌株方法的建立打下了坚实的基础。
本研究中,筛选得到一株高产氢菌株R.rubrum RM4。
在持续光照条件下,产氢量是出发菌株的1.89倍。
利用转座子上携带复制起始点的特点,将高产氢突变株基因组用BamH I进行消化、自连接、转化到大肠杆菌中,并利用转座子引物进行测序,从而得到转座子侧翼序列。
经比对,发现转座子插入破坏的基因为丙二酰-CoA脱羧酶(Malonyl-CoAdecarboxylase。
目前,并没有相关文献说明此酶与光合细菌产氢有联系,所以很可能存在其他突变位点。
3.期刊论文董洪燕.张小荣.潘志明.彭大新.刘秀梵.Hongyan Dong.Xiaorong Zhang.Zhiming Pan.Daxin Peng. Xiufan Liu转座子随机插入鉴定肠炎沙门氏菌生物膜形成相关基因-微生物学报2008,48(7[目的]生物膜在沙门氏菌的致病性和引起沙门氏菌食物中毒等方面起着重要作用,本研究为了鉴定影响沙门氏菌生物膜形成的基因.[方法]利用结晶紫染色定量法对74株鸡源的肠炎、鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌进行生物膜测定,选择生物膜生长较好的肠炎沙门氏菌C050041,采用转座子随机插入法构建突变株库.[结果]84%的鸡源沙门氏菌菌株可在塑料表面形成生物膜;通过转座子插入获得1924个突变株,筛选的生物膜降低突变株经生长曲线测定、测序和序列比对及Southern blot分析鉴定出15个插入基因,它们分别为metE、ompR、rpoS、,和G、rfaJ、rfaK、rfaP、rfbH、rhlE、spiA、steB、tpx、ybdN和2个未知功能的基因.[结论]我们鉴定出了多个影响生物膜形成的新基因,这些基因的发现为进一步研究沙门氏菌生物膜形成的调控机制,研制减毒沙门氏菌疫苗奠定了基础.4.学位论文谢春娅甘油利用型深红红螺菌突变株筛选及突变基因性质分析2009目前能源紧张,许多国家为了减少对非可再生资源石油等的依赖性,正在积极寻找新的替代能源。