玉米ZmCIPK23基因Mutator插入突变体的鉴定陈果;陈勋基;李建平;郝晓燕;常晓春;足木热木;郑军;黄全生【摘要】[目的]玉米ZmCIPK23基因的候选突变体连续与玉米自交系B73回交并自交,最终得到以B73为背景的纯合突变体,为研究该基因的功能奠定材料基础.[方法]从玉米Mutator(Mu)突变体库中定向筛选到玉米ZmCIPK23基因的候选突变体.在田间种植候选突变体,利用巢式PCR对这些后代植株进行鉴定,选择阳性植株与B73杂交.通过连续的回交及自交,最终获得该基因的纯合突变体.[结果]通过PCR 鉴定,获得了以B73为背景的ZmCIPK23基因纯合的突变体zmcipk23.[结论]获得了玉米ZmCIPK23基因的Mu插入的纯合突变体zmcipk23,为研究该基因的功能奠定了基础.%[Objective] The candidate mutants of maize ZmCIPK23 gene were continuously backcrossed and self-pollinated with B73 in fields, and finally homozygous mutants with B73 background were obtained, which laid the material foundation for studying the function of thisgene.[Method]The candidate mutants of ZmCIPK23 were screened from a maize Mutant library.They were planted and analyzed by nested PCR.The positive plants with Mu-insertion in the ZmCIPK23 gene were self-pollinated and backcrossed with B73 in the field.Thus the homozygous mutants were obtained.[Result]The homozygous mutant of ZmCIPK23 gene was obtained by PCR.[Conclusion]The homozygous mutant (zmcipk23) of Mu insertion of ZmCIPK23 gene was obtained.This study has provided a foundation for the functional analysis of the ZmCIPK23 gene.【期刊名称】《新疆农业科学》【年(卷),期】2017(054)007【总页数】6页(P1185-1190)【关键词】玉米;Mutator转座子;ZmCIPK23;突变体【作者】陈果;陈勋基;李建平;郝晓燕;常晓春;足木热木;郑军;黄全生【作者单位】新疆农业科学院核技术生物技术研究所,乌鲁木齐 830091;新疆农业科学院核技术生物技术研究所,乌鲁木齐 830091;新疆农业科学院核技术生物技术研究所,乌鲁木齐 830091;新疆农业科学院核技术生物技术研究所,乌鲁木齐830091;新疆农业科学院核技术生物技术研究所,乌鲁木齐 830091;新疆农业科学院核技术生物技术研究所,乌鲁木齐 830091;中国农业科学院作物科学研究所,北京100081;新疆农业科学院核技术生物技术研究所,乌鲁木齐 830091【正文语种】中文【中图分类】S513【研究意义】类钙调磷酸酶B互作蛋白激酶(CIPK)是植物所特有的一类蛋白激酶，在植物逆境如干旱﹑高盐应答等非生物胁迫反应中起着重要的作用，而在重要农作物玉米中CIPK基因的功能研究还非常少。
研究从反向遗传学角度出发，利用玉米Mutator转座子，定向筛选ZmCIPK23基因Mu插入的突变体。
通过PCR等鉴定方法，最终获得玉米ZmCIPK23基因的纯合突变体，为研究该基因在逆境胁迫下的功能奠定基础。
【前人研究进展】Mutator转座子在玉米功能基因组学及突变体库构建中起着非常重要的作用，利用该转座子构建了许多玉米突变体库[1]。
随着Mutator突变体库的建立，许多方法如热不对称交错PCR(TAIL-PCR)、酶切-连接-扩增(DLA)等先后用于检测Mu转座子插入位点[2, 3]。
已有研究报道，利用Mutator转座子，鉴定了5个对干旱胁迫响应的玉米蛋白磷酸酶基因[4]。
类钙调磷酸酶B互作蛋白激酶(CIPK)是植物所特有的一类蛋白激酶，该基因家族在植物非生物逆境胁迫中发挥着重要的作用。
在拟南芥中，CIPK23能够磷酸化K+转运蛋白AKT1，从而在低钾胁迫下，植株能够正常生长发育[5](Xu, 2006#2440;Ragel, 2015 #2439)。
在玉米中，对CIPK基因的功能报道有限。
ZmCIPK16受ABA、干旱、NaCl等诱导表达；ZmCIPK16过表达后能部分消除拟南芥sos2突变体对盐敏感的表型[6]。
过表达的玉米ZmCIPK21能降低转基因拟南芥中Na+的含量，增强转基因拟南芥耐盐性；并且该基因过表达后，能够互补拟南芥突变体cipk1-2[7]。
在玉米基因组中，分布着至少43个CIPK基因[8]，然而其参与的调控通路，尤其在非生物胁迫逆境中的调控途径却知之甚少，并且在玉米功能基因组学研究中，利用Mutator转座子研究CIPK基因的功能还未见报道。
【本研究切入点】玉米基因组中至少有43个CIPK基因，然而迄今为止，只有极少数的基因有功能研究报道，并且还是借助模式植物拟南芥，通过异源表达的方式进行的。
而直接在玉米基因组中研究其功能还未见报道。
研究利用玉米Mutator转座子以及PCR鉴定的方法，在玉米中鉴定并得到ZmCIPK23基因的纯合突变体，期望为该基因的功能研究奠定基础。
【拟解决的关键问题】获得可稳定遗传并纯合的ZmCIPK23基因突变体，为研究该基因在逆境胁迫下的功能奠定基础。
1.1 材料玉米ZmCIPK23基因Mu插入的候选突变体材料，回交受体材料为自交系B73。
1.2 方法1.2.1 玉米ZmCIPK23基因候选突变体材料的种植及回交将ZmCIPK23基因候选突变体材料和自交系B73分别种植于安宁渠试验场，每个材料种植3行，每行定苗15株。
行长3 m，行距60 cm，株距20 cm。
待玉米长至5～6叶，单株提取玉米叶片基因组DNA，用于PCR鉴定。
鉴定完成后，保留含有Mu因子的玉米植株，并与B73回交。
以此方法类推，直到与B73回交5代后，并自交2代，得到BC5F2代候选突变体材料。
此时对候选突变体进行基因型鉴定，保留阳性植株，自交授粉得到BC5F3代材料，用于基因型鉴定，确定所得到BC5F3代材料为ZmCIPK23基因纯合突变体材料。
1.2.2 玉米叶片基因组DNA提取玉米叶片DNA提取采用CTAB法。
2%CTAB提取液的配制：4 g CTAB、16.4 g NaCl、8 mL 0.5 M EDTA(pH=8.0)、20 mLTris.HCL(pH=8.0)溶于150 mL蒸馏水中，定容至200 mL。
所提取的DNA稀释至大约50 μg/uL，用于PCR鉴定。
1.2.3 引物设计Mu-TIR引物根据Mutator末端反向重复序列设计Mu-TIR-AGA GAA GCC AAC GCC A(AT)C GCC TC(CT) ATT TCG TC[3]。
ZmCIPK23基因的特异引物采用primer3.0在线软件设计(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)。
在ZmCIPK23基因5’端设计引物ZmCIPK23-GS5’-ACCCTGCGACAAGAAGAGGT，在ZmCIPK23基因3’端设计特异引物ZmCIPK23-GS3’-GACGAGCTCCATGACGATGTA和巢式引物ZmCIPK23-GS3N-GGTCGAGATCTCTCGCTTGAT。
图11.2.4 ZmCIPK23基因候选突变体材料的PCR鉴定及Mu插入位点的确定以ZmCIPK23基因候选突变体材料的基因组DNA为模板，用Mu-TIR作为上游引物，基因特异性引物ZmCIPK23-GS3’和巢式引物ZmCIPK23-GS3N分别作为下游引物，PCR扩增含有Mu序列的目的基因片段。
PCR反应程序为94℃ 3 min；94℃ 30 S，58℃ 30 S，72℃ 45 S，循环35次；72℃延伸7 min。
电泳检测PCR产物，若能扩增出预期大小的目的条带，且巢式PCR的条带差异也为预期值，可判断为Mu插入的阳性植株。
用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)回收ZmCIPK23基因片段，将回收片段连接到pGWC-T载体上，转化大肠杆菌DH5a。
选取阳性单克隆菌落送北京华大基因公司测序，测序结果用DNAMAN软件分析，与该基因的基因组序列比对，确定Mu插入到该基因的具体位置。
基因片段的回收参照回收试剂盒说明进行。
1.2.5 Mu转座子插入ZmCIPK23基因纯合突变体的鉴定种植BC5F2代植株，每一份BC5F2材料种植15株，PCR鉴定每株Mu插入位点的基因型。
以每一单株DNA为模板，用引物组合Mu-TIR与ZmCIPK23-GS3'，Mu-TIR与ZmCIPK23-GS3N分别扩增含有Mu序列的ZmCIPK23基因；引物组合ZmCIPK23-GS5’与ZmCIPK23-GS3'，ZmCIPK23-GS5’与ZmCIPK23-GS3N 分别扩增不含有Mu序列的ZmCIPK23基因。
根据PCR扩增结果，鉴定每一株Mu插入位点的基因型。
如果Mu-TIR与ZmCIPK23-GS3'，Mu-TIR与ZmCIPK23-GS3N扩增出含有Mu序列的ZmCIPK23基因，而ZmCIPK23-GS5’与ZmCIPK23-GS3'，ZmCIPK23-GS5’与ZmCIPK23-GS3N不能扩增出不含有Mu序列的ZmCIPK23基因，则该单株为Mu插入的纯合体。
对鉴定为纯合体的植株自交，得到BC5F3代种子。
进一步，对BC5F3代的同一插入株系，随机选取10粒种子种于温室内，单株提取DNA，采用以上引物组合进行PCR鉴定，若PCR鉴定其全部为Mu插入纯合体，则可以确定已获得可遗传的纯合Mu插入纯合突变体。
PCR反应程序为94℃ 3 min；94℃ 30 S，58℃ 30 S，72℃ 45 S，循环35次；72℃延伸7 min。