四、实验步骤Biblioteka Marker 未诱导 IPTG诱导 流穿液
20mM 50mM 100mM 200mM 1M
四、实验步骤
1、制备凝胶。取干燥洁净的玻璃板及其固定设 备组装好。先灌入2/3体积的分离胶，立即用水 封胶，封胶后保持不动。待分离胶凝固后将封胶 液倒掉，灌入压缩胶，插梳子时胶孔不能有气泡， 待压缩胶凝固后拨出梳子，若上样孔有变形，可 用适当粗细的针头拨正。
四、实验步骤
12%分离胶的配制(20ml)： 30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺 8ml 1.5M Tris-HCl(pH8.8) 5ml 10%过硫酸铵 0.2ml 10%SDS 0.2ml TEMED 8μl ddH2O 6.6ml 5%压缩胶的配制(6ml)： 30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺 1ml 1M Tris-HCl(pH6.8) 0.75ml 10%过硫酸铵 0.06ml 10%SDS 0.06ml TEMED 6μl ddH2O 4.1ml 把其他设备组装好即可进行上样和电泳检测
二、实验步骤
1、样品处理 超声破碎（20min/次） 高速离心（30min/次） 过滤膜 2、纯化
1、NTA层析柱的准备：在层析柱中加入2ml NTA 介质，并分别用10ml去离子水冲洗，10ml上样缓冲 液平衡。 2、上样：2.5ml蛋白上清液加入纯化柱内，打开阀 门，使之流出，速度控制在0.25滴/秒
四、操作步骤
2、从中取出1ml样品作为目的基因重组片段的未诱导 对照,在剩下的样品中加入IPTG(终浓度1mM),分别在 20℃培养16-20小时。 3、将收集的菌液（诱导4ml和非诱导1ml）5000rpm离 心5min收集菌体沉淀。 4、 向离心收集的菌体沉淀中加入50 μl/200μl的PBS， 涡旋重悬菌体。 6、取10ul菌液，各加入5ul的3×上样缓冲液,充分混 匀，沸煮5min（剩余菌体沉淀保存于-20℃或-80℃冰 箱）。 7、12000rpm离心5min，取上清液作为电泳样品。 8、SDS-PAGE电泳检测诱导表达的结果。
二、实验原理
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三、实验器材
恒温摇床、培养用锥形瓶、超净工作台、 离心机、灭菌锅、IPTG等
四、操作步骤
1、从平板中挑取单菌落，接入5ml含有卡那霉素(终浓度 30µg/ml)的液体培养基中，并接种空质粒菌液作为空白 对照。为获得良好的通气，培养基体积最多为三角瓶体 积的1/4，在37℃ 250rpm振荡培养OD600值至0.6-0.8。
实验十二 重组子诱导表达及检测
一、实验目的
• 通过本实验了解外源基因在原核细胞中表 达的特点和方法。
二、实验原理
大肠杆菌的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳 糖苷酶、半乳糖透过酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、 一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与 O序列结合，使操纵子受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还 有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、 O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码 基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达 。在没有乳糖 存在时，lac操纵子处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下 表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合， 抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子即可被诱导。在这个操 纵子体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b-半 乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏 蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异 丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代 谢而十分稳定，因此广泛应用。
四、实验步骤
2、上槽加入1×SDS-PAGE电泳缓冲液，下槽加入 0.5×SDS-PAGE电泳缓冲液； 3、用微量进样器每孔加入处理好的蛋白样品15µl( 上样前将胶孔的气泡清除)，低分子量蛋白质marker上 样10µl，所有蛋白样品上样前调整到等浓度； 4、开始稳流电泳，压缩胶电流为15mA，当溴酚蓝 指示带移动到压缩胶与分离胶的分界线时，将电流调 整为25mA； 5、当溴酚蓝指示带移动到距分离胶胶下缘1.5cm时 结束电泳，取出凝胶，加入染色液室温下在水平摇床 上进行考马斯染色30min，回收染色液，加入脱色液 室温振荡脱色(更换脱色液2～3次)至背景清晰。
实验十五 蛋白质电泳检测
一、实验目的
1、了解SDS-PAGE电泳原理。 2、掌握凝胶电泳实验操作方法。
二、实验原理
三、实验器材
电泳设备、30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺、1.5M TrisHCl(pH8.8)、1M Tris-HCl(pH6.8)、10%过硫酸铵、 10%SDS、TEMED等。
二、实验步骤
3、梯度洗脱，分别用不同浓度的咪唑溶液洗脱 杂蛋白，收集每个组分的洗脱液，备电泳上样。 流穿 Binding buffer， 20mM咪唑（3个柱体积）； 50mM咪唑（3个柱体积）； 100mM咪唑（5个柱体积）； 200mM咪唑（5个柱体积） ； 1M咪唑（3个柱体积）冲洗； 4、平衡柱子，用平衡液（5个柱体积）平衡柱子。
SDS—PAGE电泳检测
实验十四 外源表达蛋白的分离纯化
一、实验目的
1、了解重组蛋白亲和层析分离纯化原理和方法。
二、实验原理
• 携带有目标蛋白基因的 质粒在大肠杆菌BL21中， 在特定温度，特定终浓 度IPTG诱导下，超量表达 携带有6个连续组氨酸残 基的重组蛋白，该蛋白 可用一种通过共价偶连 的次氨基三乙酸（NTA） 使镍离子（Ni2+）固相化 的层析介质加以提纯。