木瓜蛋白酶的分离纯化
一、目的
（1）它是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁中提取粗酶液，并进一步纯化，获得高纯度的木瓜蛋白酶。

（2）通过此次试验，熟悉掌握木瓜蛋白酶分离纯化的基本步骤和原理，了解离心分离，萃取等实验技术。

二、原理
木瓜蛋白酶（ Papain ）是一种巯基蛋白酶，它分解比胰脏蛋白水解酶更多、更广泛的蛋白底物。

它也具有脂酶活力。

其分子量约为 23000 左右。

在 25 ℃ , pH6.2 时， 1 分钟生成1umol酪氨酸的酶量为 1 单位。

木瓜蛋白酶是单条肽链，有 211 氨基酸残基折叠成两部分形成裂缝，酶分子只有 1 个巯基，对酶活力是必需的，激活剂有半胱氨酸，硫化物，亚硫酸盐和 EDTA ；抑制剂有巯基试剂，包括重金属和羧基试剂和过氧化氢。

酪蛋白是一种蛋白质，它被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区275nm 处有吸收峰，根据测定 275nm 处的吸收值，可以判定木瓜蛋白酶的酶活力。

吸收值的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸收值大说明酪氨酸含量高，也就是说木瓜蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活力高。

三、实验材料
番木瓜汁；PEG (聚乙二醇，分子量为6000)； (NH4)2SO4；三氯乙酸(TCA)；酪氨酸；考马斯亮蓝
四、仪器设备
（ 1 ）离心机 4000-1000rpm （冷冻式或非冷冻式）
（ 2 ） 752 紫外分光光度计
（ 3 ）水浴箱
（ 4 ）冰箱
（ 5 ）榨汁机
五、玻璃器皿（以组为单位）
试管（ 6 ）， 100 mL 烧杯（ 2 ），吸管（ 1 ）、玻棒（ 1 ），试剂瓶（ 1000 mL 、 500 mL 、 250 mL 等），移液管或移液器
5mL(1) 、 1mL(2) 、 0.5mL （ 1 ），漏斗（ 3 ），滤纸（ 3-6 ）等
六、实验试剂配制及实验步骤
（一）酪氨酸的标准曲线
将上述各管混匀，静置2min, 测定各管的A 275nm，做标准曲线，曲线如下：
（二）粗酶活测定
1 试剂
（ 1 ） 3mg/ml 木瓜蛋白酶液（用 0.1mol/L 的磷酸缓冲液， pH 7.2 配制）
（ 2 ）0.1mol/L 的磷酸缓冲液， pH 7.2
（ 3 ）用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制含 80mmol/L 半胱氨酸
（ 4 ）1% 酪蛋白溶液：用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制（ 5 ）15% 三氯乙酸（ TCA ）溶液
2 方法
量取酶液0.2 mL，加入激活剂0.25 mL于带塞试管中，在37℃水浴中保温8 min，吸取预热37℃酪蛋白液（质量分数为1%）1 mL加入此管，在37℃水浴中反应10 min，加入三氯乙酸（TCA）2 mL摇匀，静置5 min；另取样液（已激活）0.3 mL置另一带塞试管中，加入TCA 2 mL，37℃保温10 min后，加入预热至37℃的酪蛋白液1 mL，静置5 min，测2个管的A275 nm值，同时做2个平行试验。

（三）纯化
固定体系总质量为20.5 g，在PEG（分子量6 000）质量分数为22.0%，(NH4)2SO4质量分数为14.6%，pH值为5.0，粗酶添加量为7.5%所组成的双水相体系下，室温下静置分相后，读取上、下相体积，计算相体积比R，分别测定上、下相的酶活力
（四）计算与结果
R = 9/17 = 0.529
粗酶活 = （0.103– 0.0139）/10.496/181.2 * 100000 / 0.03 = 156.16
上相酶活 = （0.32 – 0.0139）/10.496/181.2 * 100000 / 0.02 = 804.7
下相酶活 = （0.02 – 0.0139）/10.496/181.2 * 100000 / 0.012 =
26.7
酶分配系数 = 上相酶活/下相酶活 = 804.7 / 26.7 = 30.14。