氨基酸和生物资源２０１０，３２（４）：７７～８０ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ＆Ｂ ｆ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ
圆二色光谱在蛋白质结构研究中的应用 吴明和 （武汉大学生命科学院，武汉４３００７２）
摘要：近几年来，圆二色光谱在蛋白质结构研究中的应用越来越广泛。通过对远紫外圆二色光谱的测量，可以推导出稀 溶液中蛋白质的二级结构，进而分析和辨别蛋白质的三级结构类型；通过对近紫外圆二色光谱的测量和分析，可以推断蛋白 质分子中芳香氨基酸残基和二硫键的微环境变化，研究介质与蛋白质结构问的关系；通过测定实验参数和环境条件变化时的 圆二色光谱，可以研究蛋白质构像变化过程中的热力学和动力学特性。 关键词：圆二色光谱；蛋白质；二级结构；芳香氨基酸残基；二硫键 中图分类号：Ｑ５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００６—８３７６（２０１０）０４—００７７—０４
１ 蛋白质圆二色产生的分子基础和特征 １．１蛋白质圆二色产生的分子基础 由于光学活性分子对左、右圆偏振光的吸收不 同，使得左、右圆偏振光透过后变成椭圆偏振光，这 种现象就是圆二色性（Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ，简称 ＣＤ）。蛋白质是具有特定结构的生物大分子，由氨 基酸通过肽键连接而成，它具有一级结构、二级结 构、三级结构、四级结构几个主要结构层次，有的还 有结构域或超二级结构。在蛋白质和多肽分子中， 肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫桥键是 主要的光活性生色基团，当平面圆偏振光通过时，这 些生色基团对左右圆偏振光的吸收不同，造成偏振 光矢量的振幅差，使得圆偏振光变成了椭圆偏振光， 就产生了蛋白质的圆二色性¨Ｊ。圆二色光谱是一 种差光谱，是样品在左右旋偏振光照射下的吸收光 谱差值 。 １．２蛋白质圆二色特征 蛋白质的ＣＤ光谱主要是活性生色基团及折叠 结构两方面圆二色性的总和。根据电子跃迁能级能 量的大小，蛋白质的ＣＤ光谱分为三个波长范 围 ．４ ；（１）２５０ ｎｍ以下的远紫外光谱区，圆二色性 主要肽键的ｎ一叮Ｔ电子跃迁引起 （２）２５０～３００ ｎｍ 的近紫外光谱区，主要由侧链芳香基团的育一盯电 子跃迁引起；（３）３００～７００ ｎｍ的紫外一可见光光谱 区，主要由蛋白质辅基等外在生色基团引起 。远 紫外区的圆二色光谱反映了蛋白质或多肽的规则二 级结构中肽键排列的方向和能级跃迁情况，通过对 谱带位置和吸收强弱的分析对比，就能研究不同蛋 收稿日期：２０１０—０９—２７ 作者简介：吴明和，男（１９６４一）工程师 白质或多肽的二级结构；近紫外区的圆二色光谱反 映了芳香族氨基酸残基和二硫键在不对称环境中的 圆二色性，主要揭示蛋白质的三级结构信息；研究不 对称微环境的变化和影响，对肽键在远紫外区的ＣＤ信 号并不造成干扰，在研究中可以将这些信息作为光谱 探针。紫外一可见光谱主要用于辅基的偶合分析 ， 如图１是ＣＤ测定蛋白质二级结构的特征分布 。
图１ ＣＤ测定蛋白质二级结构的特征分布 （０） 一螺旋，（●）Ｂ一折叠，（△）Ｂ一转角及（▲）Ｐ２结构多肽的ＣＤ谱
从图上可以看到，特征峰谱带有明显的特点，如 表１所示。
表１ ＣＤ测定二级结构的特征峰分布 ７８· 吴明和： 圆二色光谱在蛋白质结构研究中的应用 ２蛋白质圆二色光谱测定的条件要求 ２．１样品要求 样品必须保持一定的纯度不含光吸收的杂质； 溶剂必须在测定波长没有吸收干扰；样品能完全溶 解在溶剂中，形成均一透明的溶液。 ２．２氮气流量的控制 参见表２ 表２测定波长与氮气流量 波长 氮气流速／Ｌ·ｍｉｎ ２００ ｎｍ以上 ｌ８５～２０ｏ ｎｍ １８Ｏ～１８５ ｎｍ １８０ ｎｍ以下 ３～５ ５～１０ １５～２０ ２０以上 ２．３缓冲液、溶剂要求与池子选择 缓冲液和溶剂在配制溶液前要做单独的检查， 看是否在测定波长范围内有吸收干扰，看是否形成 沉淀和胶状；在蛋白质测量中，经常选择透明性极好 的磷酸盐作为缓冲体系。 ２．４样品浓度与池子选择 样品不同，测定的圆二色光谱范围不同，对池子 大小（光径）的选择和浓度的要求也不一样。蛋白 质ＣＤ光谱测量一般在相对较稀的溶液中进行，溶 液最大吸收值不超过２，见表３。
３应用举例 ３．１利用远紫外圆二色光谱数据计算蛋白质二级 结构的分量，分析辨认蛋白质的三级结构类型。测
表３发色基团波长与样品质量浓度和池子直径的关系
定样品常用条件： 蛋白质浓度：０．２ ｇ·Ｌ一；光程：１ ｍｍ；容积： ３５０ ＩＬＬ；样品需求量低至０．１ ｍｇ；浓度适宜：根据测 量时候的数据和电压调整到合理浓度范围；稳定剂 （金属离子等）：最小；缓冲液浓度：５ ｍｍｏｌ·Ｌ （保持蛋白稳定的前提下越低越好）。 根据分子结构中不同类型的片段分量，可以将 其分成几种结构类型，如表４所示
表４不同结构的划分标准 结构类型 结构特征 全 型 全８型 ０【十８型 ａ／ｔ３型
以 ：螺旋结构为主，其分量大于４０％，而Ｂ 折叠的分量小于５％； 以Ｂ：折叠结构为主，其分量大于４０％，而Ｏｔ 螺旋的分量小于５％ 螺旋及ｐ 折叠分量都大于１５％，这两种结构在空间上是分离的，且超过６Ｏ％的折叠链是反平行排列 ０【 螺旋和Ｂ：折叠含量都大于１５％，它们在空间上是相间的，且超过６Ｏ％的折叠链平行排列 氨基酸和生物资源 ·７９· ３．２ 近紫外圆二色光谱探针反映氨基酸残基的微 环境 近紫外ＣＤ测定蛋白三级结构常用样品条件： 蛋白质浓度：１ ｇ·Ｌ 以上；光程：１０ ｍｍ；容 积：３ ｍＬ；浓度适宜：根据测量时候的数据和电压 调整到合理浓度范围；稳定剂（金属离子等）：最 小；缓冲液浓度：５ ｍｍｏｌ·Ｌ （保持蛋白稳定的前 提下越低越好）。 蛋白质中芳香氨基酸残基和二硫键处于不对称 环境中，在近紫外区２５０～３２０ ｎｍ，表现出ＣＤ信 号，通过对信号的分析，可以研究蛋白质中芳香氨基 酸残基和二硫键所处微环境的变化，推断蛋白质三 级结构的精细变化，见表５。
Ａ
表５不同芳香氨基酸残基和二硫键的ＣＤ特征 芳香氨基酸残基和二硫键 ＣＤ特征 色氨酸（Ｔｉｐ） 苯丙氨酸（Ｐｈｅ） 酪氨酸（Ｔｙｒ） 二硫键（ｓ—ｓ）
２７９、２８４和２９１ ｎｍ ２５５、２６１和２６８ ｎｍ ２７７ ｎｍ左右； ２５０～３２０ １５１／／１
３．３ 利用ＣＤ方法检测蛋白的Ｔｍ值 在连续变温条件下，监测某个特定的波长峰随 时问变化曲线，然后将扫描后的数据文件在ｓｐｅｃｔｒａ Ａｎａｌｙｓｉｓ中转换成ＴＸＴ格式文件保存，选择ｍｅｌｔｉｎｇ 方程对温度和ＣＤ值的数值关系进行分析拟合，得 出最终结果图和Ｔｍ值，如图２ 。
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ／℃ Ｂ
图２ （Ａ）还原条件下ＨＴ在５０，８０，１２０，１３０和１５０￣Ｃ时的ＣＤ光谱图。（Ｂ）ＰＡ在氧化条件（ｏ）和还原条件 （●）以及ＨＴ在氧化条件（口）和还原条件（■）不同温度下的去折叠片段。
Ａ图检测不同温度下面氧化型细胞色素ｃ的远 紫外ＣＤ谱，根据２２２ ｎｍ的［０］值计算完全去折叠 状态的氧化型细胞色素Ｃ在全部蛋白中所占的比 例，对温度作图，可以直观的得到Ｔｍ值。
参考文献 ［１］沈星灿，梁宏，何锡文，王新省。圆二色分析蛋白质构 象的方法及研究进展。［Ｊ］分析化学评述与进展 ２００４．（３）：３８８～３９４ ［２］ 丁晓岚．高红旗．圆二色光谱技术应用和实验方法。 ［Ｊ］实验技术与管理．２００８．２５（１０）４８～５２ ［３］ 黄汉昌．姜招峰．朱宏吉．表面等离子共振生物传感器 测定人免疫球蛋白的抗原活性［Ｊ］．化学通报．２００７． ７：５０１～５０５ ｆ ４］ Ｎ Ｓｒｅｅｒａｍａ．Ｒ Ｗ Ｗｏｏｄｙ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒａ．［Ｊ］Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙ— ｍｏ１．２００４．３８３：３１８～３５１ Ｍ Ｒ Ｄａｖｉｄ．Ｄ Ｈ Ｊｏｎａｔｈａｎ．Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｉｒｃｕ— ｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ｆｒｏｍ ｆｉｒｓｔ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ．［Ｊ］Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ．２００４． １６：２３４～２４３ Ｊ Ｄ Ｍｏｒｒｉｓｅｔｔ．Ｊ Ｓ Ｄａｖｉｄ．Ｈ Ｊ Ｐｏｗｎａｌ１．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａｐｏＬＰ—ａｌａｎｉｎｅ）ｗｉｔｈ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｆｌｃｈｏ— ｌｉｎｅ． Ｊ ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７３．１２：１２９０～１２９９ Ｊ Ｔ Ｐｅｌｔｏｎ ａｎｄ Ｌ Ｒ Ｍｃｌｅａｎ．Ａｎａ１．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．［Ｊ］Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０００．２７７：１６７～１７６ Ｍ Ｌｅｖｉｔｔ ａｎｄ Ｃ Ｃｈｏｔｈｉａ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｇｌｏｂｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．［Ｊ］Ｎａｔｕｒｅ．１９７６．２６１：５５２～５５８ Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｔｈｅｒｍａｌ—ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ Ｃ．『Ｊ １ ＳＯＣ．２００４． １２６，１４６８４～１４６８５ ８Ｏ· 吴明和： 圆二色光谱在蛋白质结构研究中的应用 Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｉｎ ｔｈｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｕｒｃｔｕｒｅ
Ｗｕ Ｍｉｎｇ—ｈｅ （Ｔｈｅ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｕｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｎｏｗａｄａｙｓ，ｔｈｅ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｂｅｃｏｍｅｓ ａ ｐｏｐｕｌａｒ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｔｈｅ ｆａｒ—ＵＶ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｃａｎ ｃａｌｃｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｄｉｌｕｔｅ ｓｏｌｕ ｔｉｏｎ．ａｎｄ ｔｈｅｎ ａｎａｌｙｚｅ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅ ｎｅａｒ—ＵＶ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｎ ｇｅｔ ｔｈｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｏｍａｔｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｇｒｏｕｐ ｗｈｉｃｈ ａｒｅ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ ｅｎｖｉｒｏｎ— ｍｅｎｔａｌ ｃｈａｎｇｅｓ，ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｍｅｄｉｕｍ．Ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｅｒ－ ｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｃａｎ ｂｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｉｎ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒｕｍ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒｕｍ；ｐｒｏｔｅｉｎ；ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ；ａｒｏｍａｔｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ；ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｇｒｏｕｐ